汪 峰 姚紅燕 陳若霞 陳 貴 戴瑤璐

（1 寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 浙江寧波 315040）

（2 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

（3 嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 浙江嘉興 314016）

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤氮（N）循環(huán)影響土壤肥力和作物生長，而土壤微生物是驅(qū)動氮循環(huán)過程的關(guān)鍵因子［1］。氮循環(huán)過程中，土壤氮礦化過程反映了土壤氮供應(yīng)能力，而硝化過程則是氮循環(huán)中的關(guān)鍵限速步驟。作為世界上最大的化學(xué)氮肥消耗國，我國每年氮肥用量3 000萬t（折純），占全球總量的33%［2］。礦化和硝化過程不僅決定了土壤中氮素形態(tài)的分配，還決定了硝酸鹽淋失，影響氮肥利用率和水體環(huán)境安全。

自然狀態(tài)下的海洋和陸地過渡帶為灘涂濕地，為了滿足不斷增長的糧食需求，人類將大量自然灘涂濕地圍墾成為農(nóng)業(yè)用地。據(jù)估算，我國自1950年后約有51% (2.2×104km2)的濱海自然濕地被圍墾利用［3］。盡管濱海圍墾農(nóng)田土壤受歷史因素的影響，均表現(xiàn)出高鹽、高堿和低肥的特點［4］，但圍墾利用過程中土壤鹽度、養(yǎng)分含量等條件的變化導(dǎo)致不同利用年限土壤氮轉(zhuǎn)化功能呈現(xiàn)不同特點［5-6］。研究表明，巴西瀉湖沉積物硝化強度與鹽分濃度呈顯著負相關(guān)，在0～3‰范圍內(nèi)，硝化強度隨鹽度呈指數(shù)衰減［7］。針對我國主要濱海河口沉積物的研究也發(fā)現(xiàn)，硝化速率分布有明顯的自近岸向外海逐漸降低的趨勢，高鹽度條件下的硝化作用受到抑制［8-10］。然而，以上研究對象均為沉積物，而針對海陸界面農(nóng)田土壤礦化及硝化作用規(guī)律及主要控制因子的研究鮮見報道，尤其是在圍墾后隨著農(nóng)業(yè)利用年限增加，土壤性質(zhì)的變化在多大程度上影響關(guān)鍵氮轉(zhuǎn)化功能尚不清楚。

浙江省慈溪市位于杭州灣南岸，其經(jīng)濟社會發(fā)展在很大程度上是杭州灣南岸海涂濕地圍墾的歷史。杭州灣南岸海岸變遷與灘涂圍墾的研究表明［11］，慈溪灘涂屬于淤漲型灘涂，自宋代以來已修建11道海塘，且每個海塘修建均有明確的時間記載，新中國成立前海岸線平均每年向外推移25 m，之后達到50～100 m，改革開放以來已圍墾土地1.33萬hm2，該地區(qū)目前已成為不同利用年限土壤性質(zhì)和微生物分布規(guī)律研究的典型區(qū)［12-13］。本研究以杭州灣南岸垂直海岸帶方向不同利用年限的圍墾農(nóng)田土壤為研究對象，基于室內(nèi)培養(yǎng)法分析土壤N礦化速率、硝化強度及硝化微生物數(shù)量，利用多元統(tǒng)計方法揭示海陸界面農(nóng)田土壤主要氮轉(zhuǎn)化過程和硝化微生物的分布規(guī)律及主控因素，為濱海圍墾農(nóng)田氮素管理和濱海區(qū)域環(huán)境保護提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于浙江省慈溪市（30°15′ N，121°10 ′E），地處浙江省杭州灣南岸，其海岸線北凸成弧形，是杭州灣灘涂淤漲最快的區(qū)段。該區(qū)域人口稠密，土地資源稀缺，在不同歷史時期，大量淤積海涂被圍墾改造為農(nóng)業(yè)用地。杭州灣圍墾歷史可追溯至公元5世紀［11］，民間隨海涂的地形開始壘土筑塘，隨著海涂的泥沙淤積北移，不斷增筑海塘，至今已筑至十一塘。新圍墾土壤中含鹽量較高，土壤類型歸為近代海相或河海相沉積物發(fā)育而成的濱海鹽土［14］，經(jīng)過長時間的脫鹽和熟化過程（濱海鹽土—強鹽漬化土—中度鹽漬化土—輕度鹽漬化土—脫鹽潮土）最終演變?yōu)槊擕}潮土，農(nóng)田地力也得到了較大的提升。

該地區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，因瀕臨東海又帶有海洋性季風(fēng)氣候特征。氣候溫暖多雨，年均溫16.0 ℃，無霜期244 d，最熱月均溫28.2 ℃，最冷月均溫3.8 ℃，年平均日照時數(shù)2 038 h。年均降水量為1 273 mm，年蒸發(fā)量894 mm，同時降水量季節(jié)波動性大，雨季特征明顯，約60%的降水量分布于5—9月，每年夏秋間多熱帶風(fēng)暴或臺風(fēng)。

1.2 樣品采集

圖1 土壤樣品采集位置Fig.1 Location of the soil sampling sites

2015年12月，沿垂直于海岸線方向選擇11個采樣面（圖1），包括10個不同利用年限（5～1 000 a）海塘內(nèi)農(nóng)田土壤采樣面（WT1～WT10）和1個海塘外灘涂鹽沼采樣面（WT0）。研究區(qū)域農(nóng)田主要是毛豆（春夏）-西蘭花（秋冬）輪作模式，考慮到地上作物類型會影響土壤氮轉(zhuǎn)化過程，采樣盡量選擇同一輪作模式農(nóng)田土壤（WT10區(qū)域內(nèi)無該輪作模式，因此選擇水稻田）。每個采樣面在平行于海岸線方向上選擇6個采樣點作為重復(fù)，相鄰兩個采樣點間隔不少于50 m。在西蘭花結(jié)球期用不銹鋼土鉆（2 cm）按5點采樣法采集20 cm表層土壤，混勻后用四分法留取1 kg左右，裝入密封塑料袋中帶回實驗室。除去石塊和根系，一部分土樣風(fēng)干研磨后進行理化性質(zhì)分析，另一部分置于4℃冰箱，測定硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等指標，鮮土項目的測定在2周內(nèi)完成。

1.3 測定項目與方法

土壤理化性質(zhì)測定：土壤pH采用玻璃電極測定，水土比2.5∶1；電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法，水土比5∶1；有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定；全氮采用半微量凱氏法測定；土壤堿解氮采用擴散法測定；有效磷采用Olsen-P法提取，鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用醋酸銨浸提，火焰光度法測定；和用2 mol?L-1KCl溶液浸提，流動分析儀（SKALAR San++，荷蘭）測定。以上方法參考文獻［15］。

土壤N礦化速率：采用直接測定土壤礦質(zhì)氮含量的方法［16］，稱取相當于10 g干重的新鮮土壤加入100 mL塑料瓶中，向瓶中加入用酸處理過的石英砂10 g，震蕩使土壤和石英砂混合均勻，加純水至土壤田間持水量的65%，塑料瓶口套上封口膜，并在其上方留有數(shù)個小孔來保障空氣流通，每2～3天補充損失水分。在0 d和14 d收集培養(yǎng)的土壤，測定其中的和含量。土壤N礦化速率=（培養(yǎng)后的無機氮量—培養(yǎng)前的無機氮量）/培養(yǎng)天數(shù)。

土壤硝化細菌數(shù)量采用最大或然值法（Most possible number，MPN），土壤硝化強度采用懸液培養(yǎng)法測定［17］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

聚類推進樹（Aggregated boosted tree, ABT）分析能夠預(yù)測環(huán)境變量對某個響應(yīng)指標的相對貢獻大小［18-19］，本研究利用ABT分析土地利用年限和土壤理化性質(zhì)等因子對土壤硝化強度、N礦化速率和硝化細菌數(shù)量的相對重要性。ABT分析利用“gbmplus”軟件包在R-2.7.1（http://www.R-project.org）中完成。

皮爾森相關(guān)分析和單因素方差分析（One-way ANOVA）在SPSS 20.0軟件中完成，差異顯著性采用鄧肯（Duncan）新復(fù)極差法進行檢驗；回歸擬合及其制圖在SigmaPlot 12.0中完成，文中數(shù)據(jù)計算和其余圖表制作在Excel 2012中完成。

2 結(jié) 果

2.1 不同利用年限土壤理化性質(zhì)

研究區(qū)域不同利用年限土壤理化性質(zhì)見表1。海塘外灘涂鹽沼（WT0）土壤pH呈堿性，電導(dǎo)率高達4 654 μS?cm-1，土壤含鹽量高，利用5 a（WT1），電導(dǎo)率下降81.7%（P＜0.05），而土壤pH無顯著性差異；利用20 a（WT2），電導(dǎo)率和pH與WT0相比均有顯著性變化（P＜0.05），其中土壤電導(dǎo)率下降94.1%，達輕度鹽漬化水平，土壤pH下降0.27個單位，呈弱堿性。土壤電導(dǎo)率和pH在利用50～1 000 a之間總體上呈波動下降趨勢，在利用1 000 a（WT10）下降至最低，分別達到131 μS?cm-1和7.16，土壤鹽堿性障礙基本消除。

研究區(qū)域土壤有機質(zhì)和全氮含量總體偏低（表1）。WT0土壤有機質(zhì)和全氮含量分別為10.2 g?kg-1和0.45 g?kg-1，隨著利用年限增加，土壤有機質(zhì)和全氮含量逐漸上升，在利用1 000 a后分別達到37.3 g?kg-1和1.60 g?kg-1，較WT0分別提高了2.65倍和2.52倍。土壤速效養(yǎng)分中，除速效鉀含量較豐富外，堿解氮和有效磷均缺乏；其中，土壤速效鉀隨著利用年限的增加而逐漸降低，而WT2、WT3、WT4處理土壤有效磷顯著高于其他處理；土壤堿解氮平均含量僅為45.8 mg?kg-1（除WT10外）；占總礦質(zhì)氮的90.4%，其中，WT4、WT5、WT6處理土壤顯著高于其他處理。

2.2 不同利用年限土壤硝化強度

通過培養(yǎng)法計算土壤的硝化強度如圖2所示。不同利用年限土壤硝化強度介于14.3%～60.5%之間，隨著利用年限的延長，土壤硝化強度趨于升高。土壤硝化強度大致可劃分為3個梯度：1）高硝化強度，200～1 000 a（WT6、WT7、WT8、WT9、WT10），平均為56.8%；2）中等硝化強度，20～120 a（WT2、WT3、WT4、WT5），平均為37.5%；3）低硝化強度，0～5 a（WT0、WT1），平均僅為17.4%。方差分析表明，3個不同梯度層次樣品間土壤硝化強度均存在顯著性差異（P ＜0.05）。

表1 不同樣點土壤部分理化性質(zhì)Table 1 Soil physicochemical properties relative to location of the sampling site

2.3 不同利用年限土壤氮礦化速率

圖2 不同處理下土壤硝化強度Fig.2 Nitrification intensity of soils relative to treatment

不同利用年限土壤氮礦化速率如圖3所示。220～1 000 a樣品（WT7、WT8、WT9、WT10）土壤礦化速率最高，平均達3.5 mg?kg-1?d-1，顯著高于其他年限樣品（P＜0.05）；0～50 a樣品（WT0、WT1、WT2、WT3）礦化速率中等，平均為2.5 mg?kg-1?d-1；60～200 a樣品（WT4、WT5、WT6）礦化速率最低，平均僅為0.5 mg?kg-1?d-1，顯著低于其他樣品（P＜0.05）。

2.4 不同利用年限土壤硝化細菌數(shù)量

圖3 不同處理下土壤氮礦化速率Fig.3 N mineralization rate of soils relative to treatment

圖 4 不同處理下土壤硝化細菌數(shù)Fig.4 Number of soil nitrobacteria relative to treatment

不同利用年限硝化細菌數(shù)量如圖4所示。土地利用初期（0～5 a），土壤中硝化細菌數(shù)量處于較低水平，每克土壤平均僅有0.2×103個，隨著利用時間增加，硝化細菌數(shù)快速增加，WT2相比WT1增加了7.7倍。土壤硝化細菌數(shù)量在WT3和WT4處理達到最高，每克土壤平均3.0×103個。在60～1 000 a，隨著利用時間的延長，土壤硝化細菌數(shù)量逐漸降低（除WT7），最終在WT10處理中僅為0.1×103g-1。

2.5 不同利用年限土壤硝化強度、氮礦化速率和硝化細菌數(shù)量的影響因子

將土壤硝化強度、氮礦化速率和硝化細菌數(shù)量與土壤相關(guān)性質(zhì)進行相關(guān)分析（表2），結(jié)果表明，土壤硝化強度與利用年限、有機質(zhì)、全氮和堿解氮呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與土壤含水率、pH、電導(dǎo)率和速效鉀呈顯著負相關(guān)（P＜0.01）。氮礦化速率與利用年限、有機質(zhì)、全氮、堿解氮呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與土壤pH、和有效磷呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。硝化細菌數(shù)與土壤有效磷呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與利用年限、土壤含水率、電導(dǎo)率、有機質(zhì)、全氮、堿解氮呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

將表2中篩選到的具有顯著性相關(guān)的因子分別加入ABT模型進行分析（圖5），結(jié)果表明，土壤利用年限對硝化強度的影響最大（45%），其次是電導(dǎo)率（12%）和有機質(zhì)（11%），其余因子貢獻率均不足10%；含量是影響N礦化速率的主要因素（86%）；影響硝化細菌豐度變化的相對貢獻率由大到小依次為：有效磷、利用年限、堿解氮、全氮、含水量、電導(dǎo)率、有機質(zhì)，其中有效磷貢獻率達42%。

2.6 土壤硝化強度、氮礦化速率和硝化細菌數(shù)量與影響因子的回歸模擬

為了表征土壤硝化強度、氮礦化速率和硝化細菌數(shù)量隨利用年限的變化規(guī)律，通過回歸模擬的方法構(gòu)建線性回歸方程（圖6）。硝化強度隨利用時間的變化方程為y=56.4x /(x+15.9)，氮礦化速率隨利用時間的變化方程為y=2.717+0.001 1x，硝化細菌數(shù)量隨利用時間的變化方程為Ln(y)=7.061+0.002 3x。此外，根據(jù)表2中的相關(guān)分析，選取對硝化強度、氮礦化速率和硝化細菌數(shù)量貢獻率最大的土壤理化因子做回歸分析（圖6），硝化強度隨電導(dǎo)率變化的方程為y=74.1-68.0x /(x+448.7)，氮礦化速率隨變化的方程為y=3.471-0.073x，硝化細菌數(shù)量隨有效磷變化方程為Ln(y)=8.8x /(x+3.1)。

表2 土壤硝化強度、氮礦化速率、硝化細菌數(shù)量與土壤性質(zhì)的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation analysis of nitrification intensity, N mineralization rate and number of nitrobacteria with soil properties

圖5 基于ABT模型預(yù)測土壤性質(zhì)對硝化強度 a)、氮礦化速率 b)和硝化細菌數(shù)量 c)的相對重要性Fig.5 Relative importance of soil properties to nitrification intensity a), N mineralization rate b) and number of nitrobacteria c) as predicted with the aggregated boosted tree (ABT) model

圖6 基于回歸法分析土壤硝化強度、氮礦化速率、硝化細菌數(shù)量與部分土壤性質(zhì)的關(guān)系Fig.6 Relationships of some soil property indices with nitrification intensity, N mineralization rate and number of nitrobacteria based on regression analysis (n=66)

3 討 論

本研究以位于浙江慈溪市不同利用年限濱海圍墾農(nóng)田土壤為研究對象，探索土壤氮轉(zhuǎn)化關(guān)鍵過程（礦化和硝化）及硝化微生物分布規(guī)律。近10年來，年代序列土壤發(fā)生演變已成為世界土壤學(xué)研究熱點［20］，研究地點主要選擇在杭州灣南岸圍墾灘涂地，還有部分選擇珠江三角洲、崇明島等濱海區(qū)域［12］。這些研究對不同利用年限土壤形態(tài)［21］、有機碳［22］、pH［23］、鐵氧化物［24］、磷吸附轉(zhuǎn)運［25］等進行了全面的調(diào)查分析，證實了農(nóng)業(yè)活動有利于土壤中碳、氮、磷等養(yǎng)分元素積累，但目前尚不清楚不同土壤養(yǎng)分達到“穩(wěn)定狀態(tài)”所需的時間。利用年代序列法（Chronosequence approach）研究發(fā)現(xiàn)，水田耕作條件下，表層土壤有機碳和大量元素（Ca、Mg、Na、P）在50 a內(nèi)可發(fā)生顯著變化，而土壤形態(tài)和鐵氧化物至少需要1 000 a［12］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，土壤電導(dǎo)率和pH在農(nóng)業(yè)利用50 a內(nèi)快速下降，隨后呈現(xiàn)波動下降趨勢（表1）；而土壤有機質(zhì)和全氮雖然總體隨利用時間延長處于上升趨勢，但利用前50 a內(nèi)增加幅度顯著高于后期。不同土地利用方式（如水田和旱地）對土壤性質(zhì)演變有顯著影響，K?lbl等［21］研究表明，水田管理相對于旱地加速了土壤成土過程。本研究雖然以旱地土壤為對象，但也存在著一定的水田耕作歷史，慈溪濱海鹽堿土在農(nóng)業(yè)利用初期一般通過種植水稻對土壤洗鹽、排鹽，至少3～5 a后才可改為旱地利用，導(dǎo)致利用初期土壤性質(zhì)快速變化。

本研究表明，利用5～1 000 a的農(nóng)田土壤平均硝化強度為45.4%，雖然高于南方酸性紅壤，但低于東北黑土和華北平原的潮土［26］。濱海圍墾農(nóng)田土壤母質(zhì)為海洋和河口沉積物，土壤微生物受鹽堿脅迫，導(dǎo)致杭州灣濱海鹽土區(qū)總體硝化強度受抑制，針對閩江口沉積物的研究也表明硝化強度總體偏低［27］。除了成土歷史因素外，本研究證實土壤鹽度（電導(dǎo)率）是影響濱海圍墾農(nóng)田土壤硝化強度的主要影響因子（圖5）。鹽度主導(dǎo)沉積物硝化等氮轉(zhuǎn)化過程已有諸多報道［28-29］。研究者針對巴西瀉湖沉積物研究發(fā)現(xiàn)，在0～3‰范圍內(nèi)硝化強度隨鹽度呈指數(shù)衰減［7］，在珠江、長江和黃河三角洲的研究也發(fā)現(xiàn)，較高的鹽度對硝化過程有明顯的抑制作用，而低鹽條件下的含鹽量變化對土壤硝化強度影響不明顯［8-10］。本研究也證實，濱海圍墾農(nóng)田土壤隨著利用年限的延長，土壤鹽度下降，土壤硝化強度趨于升高（圖2），與以上研究結(jié)果一致。胡君利等［13］基于慈溪圍墾農(nóng)田研究發(fā)現(xiàn)，隨著利用年限的延長，水稻土的硝化強度趨于下降；Jiang等［30］同樣發(fā)現(xiàn)300 a水稻土硝化作用和氮礦化速率均高于利用700 a土壤。以上兩項研究與本文結(jié)果不一致的原因可能是其對象為水稻土，水田在大部分時間處于淹水狀態(tài)，而硝化微生物需要通過氧化氨分子獲得能量維持其生存與生長，因此，硝化強度受氧供應(yīng)及土壤pH強烈影響［31］。研究表明，生態(tài)系統(tǒng)類型是土壤硝化過程地理分異規(guī)律的最優(yōu)解釋因子，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)硝化速率顯著高于濕地，也一定程度證明淹水缺氧條件對土壤硝化過程的抑制作用［32］。

關(guān)于土壤微生物分布是歷史因素還是當代環(huán)境條件決定的，目前學(xué)術(shù)界尚存在爭議。本研究利用空間換時間的方法研究了硝化細菌數(shù)量和硝化強度在大時間尺度下的變化規(guī)律，排除了大尺度下研究中受不同土壤類型的干擾，具有較強的代表性。本研究中歷史因素（利用年限）對硝化強度和硝化細菌數(shù)量的貢獻率分別為45%和15%，其余均為當代環(huán)境條件（有效磷、電導(dǎo)率等土壤理化性質(zhì)）所貢獻。因此，本研究表明了主導(dǎo)杭州灣灘涂圍墾農(nóng)田土壤硝化細菌數(shù)量和硝化強度的是當代環(huán)境條件，與Sun等［33］基于長期土壤移置試驗的結(jié)論一致。濱海鹽堿土壤除了受鹽度脅迫外，土壤養(yǎng)分含量極低，致使微生物及其功能還易受養(yǎng)分供給脅迫，因此，當代環(huán)境因子對其有更大的影響。例如，本研究表明，有效磷是硝化細菌豐度的主要影響因素（圖5）。磷元素不僅是微生物重要組成元素，同時也參與微生物代謝，相關(guān)研究也表明，土壤中有效磷的供給是微生物物種分化主要控制因素［34］，同時也是微生物生長繁殖的主要限制因子［35］。

土壤是一個復(fù)雜的動態(tài)系統(tǒng)，探尋土壤微生物多樣性與功能的關(guān)系非常困難［36］。本研究中，雖然在利用前期（0～5 a）土壤硝化強度與硝化細菌數(shù)量均處于較低水平，但隨著利用年限的增加，兩者變化趨勢出現(xiàn)較大的差異（圖2、圖4），相關(guān)分析同樣表明硝化細菌數(shù)量與硝化強度無顯著相關(guān)性（r=0.093，P=0.456）。導(dǎo)致以上結(jié)果的主要原因可能是：1）隨著利用年限增加，有機碳等養(yǎng)分供應(yīng)充足，硝化微生物活性增強，因此，20～120 a土壤硝化微生物很可能出現(xiàn)功能冗余；2）一定的鹽度范圍有利于硝化微生物增殖［28］，但硝化活性受抑制；3）土壤中是影響礦化速率的主要因子（圖5），作為底物影響了硝化微生物數(shù)量；4）未考慮到硝化微生物群落分布及微生物間的相互作用［37］。利用高分辨率的測序和分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建技術(shù)，分析不同利用年限農(nóng)田土壤硝化微生物群落分布及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，闡明土壤硝化功能的關(guān)鍵生物因子，是土壤生物地理學(xué)需要重點關(guān)注的研究內(nèi)容。

4 結(jié) 論

本研究選取杭州灣南岸的不同利用年限濱海圍墾農(nóng)田土壤為研究對象，通過比較不同利用年限的海陸界面農(nóng)田關(guān)鍵土壤過程，以空間換時間，探索在大時間尺度下（0～1 000 a）海陸界面旱地土壤關(guān)鍵氮素轉(zhuǎn)化過程和硝化細菌生物演變規(guī)律。研究結(jié)果表明，隨著土壤利用年限的增加，土壤鹽度和pH下降，土壤C、N等含量逐漸積累，且利用前50 a內(nèi)變化幅度較大；土壤硝化強度隨著利用時間的延長而趨于升高，其主要影響因子是利用年限（45%）；土壤中是影響N礦化速率的主要因子（86%），利用220～1 000 a土壤有較高的礦化速率；土壤硝化細菌數(shù)量表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，土壤有效磷是其關(guān)鍵限制因子（42%）。海陸界面土壤在農(nóng)業(yè)持續(xù)利用過程中，隨著土壤鹽堿下降至一定的范圍內(nèi)，硝化強度得到一定提高，今后要利用綜合調(diào)控手段以避免農(nóng)田N素淋失對沿海漁業(yè)和生態(tài)環(huán)境帶來的負面影響。