陳秀波 朱德全 趙晨晨 張路路 陳立新 段文標(biāo)?

（1 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

（2 貴州財(cái)經(jīng)大學(xué)藝術(shù)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

（3 佳木斯大學(xué)理學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007）

（4 佳木斯大學(xué)中-烏農(nóng)林技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯 154007）

紅松（Pinus koraiensis）是我國(guó)東北地區(qū)珍貴針葉樹種，以紅松為建群種的混交林是該地區(qū)最具代表性的地帶性頂級(jí)植被類型，也是我國(guó)溫帶針闊混交林帶內(nèi)最典型、最多樣和最重要的森林生態(tài)系統(tǒng)，具有極高的生產(chǎn)力和生態(tài)地位。該區(qū)域氣候寒冷、土壤潮濕、有島狀永久性凍土存在，屬于全球氣候變化敏感區(qū)域［1］。從19世紀(jì)開始，大量的原始紅松林被砍伐，使其遭到嚴(yán)重破壞，除了少數(shù)保護(hù)區(qū)外，原始紅松林已基本消失［2］。

欲保護(hù)和維持紅松林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，需要分析原始紅松林對(duì)環(huán)境的適應(yīng)、重要物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的過(guò)程及規(guī)律。土壤真菌作為分解者存在于森林生態(tài)系統(tǒng)中，參與物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息的傳遞［3-4］。它們?cè)诜纸馍值蚵湮?、轉(zhuǎn)變有機(jī)質(zhì)、改善土壤環(huán)境和為樹木根系提供營(yíng)養(yǎng)等方面扮演著重要角色［5］。真菌群落組成和多樣性特征的研究對(duì)于紅松林保護(hù)，食品和醫(yī)藥工業(yè)的真菌資源開發(fā)具有重要意義。

近些年對(duì)紅松林土壤微生物的研究主要是采用稀釋平板法和Biolog-ECO微平板檢測(cè)法。雖然有晁開瑞［6］、吳慶禹［7］、董愛(ài)榮［8］等對(duì)椴樹紅松林、楓樺紅松林、紅松人工林等林型土壤真菌的組成和多樣性進(jìn)行了報(bào)道，但都是基于培養(yǎng)手段進(jìn)行研究的。森林土壤真菌數(shù)量巨大，種類繁多。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法不能覆蓋土壤中絕大多數(shù)真菌，難以反映真菌群落多樣性全貌［9］。目前，對(duì)同一物種或不同物種的不同菌株間進(jìn)行真菌分類鑒定或系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究，通常利用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔（Internal transcribed spacer，ITS）序列的差異進(jìn)行比較分析［10］。以Illumina公司為代表的Miseq二代測(cè)序技術(shù)，具有通量高、重復(fù)性好、價(jià)格便宜、讀長(zhǎng)合適等優(yōu)點(diǎn)。ITS較rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)的變異率高，能有效區(qū)分親緣關(guān)系比較相近的菌株［11］，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境［12-13］和醫(yī)療等相關(guān)研究領(lǐng)域。

不同林型的紅松林由于植被組成不同，土壤理化性質(zhì)各異，可能會(huì)引起真菌群落組成和多樣性的不同。本研究選取黑龍江省伊春市涼水國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)兩種典型原始紅松混交林（云冷杉紅松林和椴樹紅松林）、紅松人工林和紅松天然次生林四種林型，采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)，分析這四種林型土壤真菌群落組成和多樣性特征，以便為紅松林的保護(hù)、人工植被恢復(fù)和真菌資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地位于小興安嶺涼水國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，地處黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)。地理坐標(biāo)為東經(jīng)128°53′20″，北緯47°10′50″。該區(qū)地帶性植被類型是以紅松為主的混交林，土壤為山地暗棕色森林土，母質(zhì)是坡積或沖積母質(zhì)上發(fā)育的腐殖質(zhì)沼澤土或泥炭腐殖質(zhì)沼澤土。研究區(qū)域具有明顯的溫帶大陸性季風(fēng)氣候特征，年均最高氣溫7.5 ℃，最低氣溫-6.6 ℃，平均-3℃，年均地溫1.2 ℃。年均降水量667 mm，年均相對(duì)濕度78%。在該區(qū)域內(nèi)，選取兩種典型的原始紅松林（云冷杉紅松林和椴樹紅松林）、紅松人工林和紅松天然次生林四種林型為研究對(duì)象。在每種林型的陽(yáng)坡上，設(shè)置四塊面積為25 m×25 m的樣地。四種林型中喬木均以紅松作為建群樹種，各樣地基本信息見(jiàn)表1。紅松人工林植物群落相對(duì)比較單一，喬灌木種類少并且高度矮于其他三種林型。四種林型中的藤本植物主要為狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikta）和忍冬（Lonicera japonica）。草本植物主要以鱗毛蕨（Dryopteris）、猴腿蹄蓋蕨（Athyrium multiden tatum）、蚊子草（Filipendula Palmata）為主。

1.2 土壤樣品采集和理化因子的測(cè)定

選擇微生物活動(dòng)最為活躍的7月份采集土壤樣品。在每個(gè)樣地，沿“S”形曲線隨機(jī)設(shè)置5個(gè)取樣點(diǎn)，小心移去每個(gè)取樣點(diǎn)土壤表面凋落物，使用內(nèi)徑為5 cm的土鉆和100 cm3環(huán)刀，采集0～20 cm表層土壤樣品，每個(gè)樣地重復(fù)采樣3次，將其混合均勻后裝入無(wú)菌自封袋，分兩份保存。其中一份用于測(cè)定土壤真菌群落多樣性，-80 ℃冰箱中保存；另一份土壤風(fēng)干去雜質(zhì)后過(guò)篩，用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。

根據(jù)土壤常規(guī)分析方法測(cè)定土壤理化性質(zhì)［14］。使用pH計(jì)測(cè)定土壤pH；使用環(huán)刀法測(cè)定土壤容重和土壤孔隙度；采用烘干法測(cè)定土壤含水量和凱氏定氮法測(cè)定全氮；有機(jī)碳含量測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化法；采用鉬銻抗比色紫外分光光度法測(cè)定全磷含量。每份樣品各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 土壤微生物DNA提取及ITS基因測(cè)序

稱取0.5 g新鮮土樣，采用Fast?DNA SPIN Kit（MP Biomedicals，CA，USA）提取土壤微生物的總DNA，然后采用PowerClean?DNA Clean-up Kit (MoBio, CA, USA)對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳定性檢測(cè)后，再采用Nanodrop 2000（Thermo，USA）測(cè)定其濃度及純度，最后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?duì)每份樣品，采用引物ITS1/ITS2（ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)，ITS2：5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）擴(kuò)增ITSI片段［15］。PCR步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)相同樣本混合后的PCR產(chǎn)物，使用Axy Prep DNA 凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對(duì)PCR產(chǎn)物在Microplate reader（BioTek, FLx800）上進(jìn)行定量，然后按照每個(gè)樣品所需的數(shù)據(jù)量進(jìn)行混樣，構(gòu)建Miseq文庫(kù)。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)。根據(jù)該試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，純化富集后的文庫(kù)經(jīng)過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行最終的片段選擇與純化。

表1 四種林型樣地基本信息Table 1 Basic information of the sampling sites in the four types of Pinus koraiensis forests

1.4 高通量測(cè)序及下機(jī)數(shù)據(jù)處理

依據(jù)PCR產(chǎn)物濃度，將所有擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物等量混合，采用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行雙末端250 bp測(cè)序。數(shù)據(jù)下機(jī)后，根據(jù)barcode標(biāo)簽序列和前引物序列篩選出有效序列，去除Reads接頭和barcode序列，同時(shí)用FLASH軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去掉含有不確定堿基的序列、平均質(zhì)量小于Q20、最終長(zhǎng)度小于50 bp的序列以及去除含N堿基的reads。根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接成一條序列，最小overlap長(zhǎng)度為10 bp。采用Usearch（vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/）去除嵌合體序列，并對(duì)有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.5 生物信息學(xué)分析

使用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST這一序列比對(duì)工具［16］，對(duì)獲得的高質(zhì)量序列，按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU(Operational taxonomic units，OTU)劃分，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。隨后，根據(jù)每個(gè)OTU在每個(gè)樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件（即OTU table）。在QIIME軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，通過(guò)將OTU代表序列與真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)Unite（Release 6.0 http://unite.ut.ee/index.php）的模板序列相比對(duì)，獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。另外將豐度值低于全體樣本測(cè)序總量0.001%的OTU去除，并以O(shè)TU豐度矩陣中最小樣本的序列數(shù)進(jìn)行抽平，去除稀有OTU的OTU豐度矩陣用于后續(xù)分析。

使用QIIME軟件，對(duì)OTU豐度矩陣中每個(gè)樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機(jī)抽樣，以每個(gè)深度下抽取到的序列數(shù)及其對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)繪制稀疏曲線。根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，使用QIIME軟件，可以獲得每個(gè)樣本在各分類水平(界、門、綱、目、科、屬、種)的具體組成，并通過(guò)柱狀圖進(jìn)行表示。根據(jù)獲得的OTU豐度矩陣，使用R軟件計(jì)算各樣本（組）共有或特有的OTU數(shù)量，并采用韋恩圖展示。同時(shí)使用R軟件，繪制門水平和屬水平群落Bar圖。使用QIIME軟件分別對(duì)每個(gè)樣本計(jì)算四種α多樣性指數(shù)：Chao1豐富度估計(jì)指數(shù)、Ace 豐富度估計(jì)指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）和辛普森指數(shù)（Simpson index）。通過(guò)R軟件，對(duì)四種林型的真菌群落組成進(jìn)行基于UniFrac距離算法PCoA分析（principal coordinate analysis）和ANOSIM（Analysis of similarities）分析，通過(guò)對(duì)樣本間距離判斷樣本差異大小。通過(guò)在線LEfSe（LDA Effect Size）軟件對(duì)四種林型的差異真菌進(jìn)行分析，找出不同林型中具有顯著性差異的真菌物種，設(shè)置LDA（Linear Discriminant Analysis）score的閾值為2。采用典范對(duì)應(yīng)分析（Canonical correspondence analysis，CCA）和Spearman相關(guān)性進(jìn)行土壤理化因子和真菌群落組成的關(guān)聯(lián)分析，本研究所涉及的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS v16.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 四種林型紅松林的土壤理化性質(zhì)

兩種原始紅松林的土壤理化性質(zhì)除水分含量和總孔隙度差異顯著外，pH、總有機(jī)碳、全氮、全磷、土壤容重均無(wú)顯著差異（表 2）。紅松天然次生林與其他三種林型之間多數(shù)土壤理化因子（pH、總有機(jī)碳、全氮、全磷）差異顯著。

表2 四種林型紅松林的土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of the soil under the four types of Pinus koraiensis forests

2.2 土壤樣品測(cè)序結(jié)果及測(cè)序深度評(píng)估

通過(guò)對(duì)土壤真菌的ITS片段測(cè)序，16個(gè)土壤樣品一共獲得534 359條有效序列，經(jīng)過(guò)優(yōu)化過(guò)濾低質(zhì)量序列得到505 299條優(yōu)質(zhì)序列。供試土壤樣品序列經(jīng)拆分、去冗余后在97%的相似度下進(jìn)行OTU聚類，四種林型一共獲得1 316個(gè)OTUs。如圖1所示，16個(gè)土壤樣品稀釋曲線基本趨于平緩，測(cè)序深度基本能反映四種林型土壤真菌群落。

不同林型土壤環(huán)境中真菌OTU數(shù)目的Venn圖可以看出（圖2a），云冷杉紅松林獲得的OTU數(shù)目最多（629），其次是椴樹紅松林（544）和紅松人工林（392），紅松天然次生林最低（302）。并且四種林型土壤共有的OTU數(shù)目較少（59個(gè)），然而在綱水平的Venn圖顯示，四種林型樣地共有真菌17綱（圖2b）。

2.3 四種林型紅松林土壤真菌群落α多樣性

本試驗(yàn)采用體現(xiàn)真菌群落豐富度的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)，真菌群落多樣性的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)以及群落覆蓋度的Coverage指數(shù)，α多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表 3。

由表 3中看出，云冷杉紅松林的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)＞椴樹紅松林＞紅松人工林＞紅松天然次生林（其中椴樹紅松林和云冷杉紅松林的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)與紅松天然次生林差異顯著，P＜0.5）。體現(xiàn)群落多樣性的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)：椴樹紅松林＞云冷杉紅松林＞紅松人工林＞紅松天然次生林，但差異不顯著。本次測(cè)序的覆蓋率均在99%以上，進(jìn)一步證實(shí)測(cè)序結(jié)果較好的代表土壤樣本中真菌群落組成的真實(shí)情況。

2.4 四種林型紅松林土壤真菌群落組成及差異物種

圖1 每個(gè)土壤樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of each soil sample

圖2 四種林型紅松林土壤真菌韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the soil fungi of four types of Pinus koraiensis forests

表3 不同林型紅松林土壤真菌α多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of the soil fungi in different types of Pinus koraiensis forests

四種林型16個(gè)土壤樣品的OTU代表序列經(jīng)比對(duì)鑒定得到7門、25綱、79目、166科、290屬、441種的土壤真菌物種信息。四種林型土壤真菌群落門水平上主要屬于5個(gè)類群（圖3），主要包括子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、分類地位未鑒定真菌（unclassified-k-Fungi）、接合菌門（Zygomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota）。根據(jù)LEfSe分析的LDA判別分值(表4)也發(fā)現(xiàn)：在門分類水平上，椴樹紅松林土壤中擔(dān)子菌門與其他三種林型差異顯著。此外，羅茲菌門只在紅松人工林中檢測(cè)到，而在云冷杉紅松林、椴樹紅松林和紅松天然次生林中未被檢測(cè)到。

圖3 四種林型紅松林土壤真菌門水平上的群落豐度Fig.3 Abundance graph of the soil fungal community of four types of Pinus koraiensis forests at phylum level

在屬分類水平上，去除相對(duì)豐度小于0.02%的其他菌屬后，四種林型包含23屬土壤真菌（圖4），各種林型均含有大量未被鑒定的真菌，相對(duì)豐度在15.20%～29.22%。同時(shí)根據(jù)LEfSe分析的LDA分值（表4），在屬分類水平上，四種林型一共有19個(gè)差異真菌屬，其中椴樹紅松林土壤中顯著性差異的真菌屬最多（10個(gè)），紅松天然次生林中最少（1個(gè)）。

2.5 四種林型紅松林土壤真菌群落β多樣性

對(duì)四種林型土壤真菌群落在OTU水平上進(jìn)行基于unweighted UniFrac距離算法的主坐標(biāo)分析（圖5）顯示：椴樹紅松林的土壤真菌群落可以與其他三種林型距離較遠(yuǎn)，可以分開。同時(shí)結(jié)合ANOSIM分析四種林型土壤真菌群落的相似性，結(jié)果顯示：在考慮真菌物種豐度和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化距離的情況下，OTU水平四種林型紅松林土壤真菌群落組成差異顯著（R=0.537，P=0.001），但兩種原始林（云冷杉紅松林和椴樹紅松林，P=0.064）、人工林和天然次生林之間(P=0.181)組成相近，差異不顯著。

2.6 四種林型紅松林土壤真菌群落與土壤因子的相關(guān)性

采用CCA分析探究影響四種林型土壤真菌群落組成的環(huán)境因子。選擇7個(gè)對(duì)微生物群落有顯著作用的土壤理化因子（pH、水分含量、土壤總孔隙度、土壤容重、總有機(jī)碳、全氮、全磷）結(jié)合OTUs表格進(jìn)行分析。分析發(fā)現(xiàn)全氮、總有機(jī)碳、pH、水分含量和土壤總孔隙度5個(gè)理化因子對(duì)土壤真菌群落組成有顯著性影響（P＜0.05）。同時(shí)根據(jù)各環(huán)境因子在第一軸的投影顯示，土壤全氮可能是影響四種林型土壤真菌群落組成的主要因子，其次為總有機(jī)碳（圖 6）。

圖4 四種林型紅松林土壤真菌屬水平上的群落豐度Fig.4 Abundance graph of the soil fungal community of four types of Pinus koraiensis forests at the genus level

表4 四種林型紅松林土壤顯著性差異真菌門和屬的LDA分值Table 4 LDA scores of fungal phyla and genera with significant difference in soil of four types of Pinus koraiensis forests

圖5 四種林型紅松林土壤真菌群落基于unweighted UniFrac距離的主坐標(biāo)分析Fig.5 PCoA analysis of soil fungal community in four types of Pinus koraiensis forests based on unweighted uniFrac distance

圖6 四種紅松林土壤真菌群落組成與土壤理化因子間的典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）Fig.6 Canonical correspondence analysis (CCA) between soil physicochemical factors and soil fungal community composition of four types of Pinus koraiensis forests

同時(shí)采用Spearman相關(guān)性系數(shù)分析不同土壤理化因子與豐度前20的土壤真菌屬相對(duì)含量之間的相關(guān)性，相關(guān)性熱圖見(jiàn)圖7。從圖7中可以看出，土壤pH與馬拉色氏霉菌屬的相對(duì)含量顯著正相關(guān)，與unclassified-o-Archaeorhizomyces顯著負(fù)相關(guān)。土壤水分含量與Sebacina和unclassifiedf-Thelephoraceae顯著正相關(guān)。土壤總孔隙度與紅菇屬和乳牛肝菌屬顯著正相關(guān)。土壤全磷與unclassified-o-Archaeorhizomyces顯著負(fù)相關(guān)。土壤總有機(jī)碳含量與四個(gè)菌屬顯著相關(guān)。土壤全氮與六個(gè)菌屬顯著相關(guān)。

3 討 論

圖7 四種紅松林土壤因子和真菌群落組成相關(guān)性熱圖Fig.7 Correlation heatmap of soil physicochemical factors and composition of soil fungal community of four types of Pinus koraiensis forests

Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展提供了一個(gè)強(qiáng)大高效的平臺(tái)，可以迅速有效地分析微生物的群落結(jié)構(gòu)組成［17］。有學(xué)者認(rèn)為，微生物群落的整體組成在不同生境中的差異可能較大，但優(yōu)勢(shì)菌群基本相似。本研究也發(fā)現(xiàn)四種林型土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門和擔(dān)子菌門，兩種類群的真菌含量超過(guò)70%，其中子囊菌門和擔(dān)子菌門在各林型中的相對(duì)組成比例都超過(guò)70%為優(yōu)勢(shì)菌門，但兩個(gè)菌門在四種林型中豐度各有差異，其中子囊菌門在紅松人工林中的相對(duì)豐度最高(64.82%)，紅松天然次生林次之（58.00%），椴樹紅松林最低（35.09 %）；擔(dān)子菌門在椴樹紅松林的相對(duì)豐度最高（45.65%），云冷杉紅松林次之（29.12%），紅松天然次生林最低（11.81%）。兩種優(yōu)勢(shì)菌門與以往的一些研究結(jié)果類似［13,18-19］。如喬沙沙等［18］利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析了關(guān)帝山龐泉溝自然保護(hù)區(qū)四種林型的5個(gè)土壤真菌群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)樣地中共有7個(gè)真菌門和322個(gè)真菌屬，其中子囊菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度最大。

在屬分類水平上，四種林型紅松林土壤中均含有大量未鑒定的真菌菌屬，在已經(jīng)鑒定的真菌菌屬中，按豐度高低依次為子囊菌門中未分類菌unclassified-p-Ascomycota、Leptodontidium、擬青霉屬（Simplicillium）、Sebacina、糞殼菌綱中未分類菌（unclassifiedc-Sordariomycetes）、紅菇屬（Russula）、unclassified-O-Archaeorhizomycetales、青霉屬（Penicillium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、Archaeorhizomycetales、Pichia酵母屬（Pichia）、Telephora、乳牛肝菌屬（Suillus）、Geminibasidium、馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）等。其中以Leptodontidium、擬青霉屬、Sebacina、紅菇屬、青霉屬和隱球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，這與一些森林土壤中鑒定的真菌優(yōu)勢(shì)菌屬有異同點(diǎn)。相同的是在一些森林土壤真菌研究中，青霉屬都為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，但含有其他不同的優(yōu)勢(shì)真菌屬。如趙文靜等［20］對(duì)額爾古納國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)四種林型土壤真菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)土壤真菌孢霉屬（Mortierella）和青霉屬為各林型土壤真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬。孫璐等［21］研究長(zhǎng)白山北坡森林土壤低溫真菌的種群分布發(fā)現(xiàn)被孢霉屬、毛霉屬、青霉菌屬和彎頸霉屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。此外，董愛(ài)榮等［8］采用培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)在椴樹紅松林、楓樺紅松林和紅松人工林土壤真菌中被孢霉屬、青霉屬、木霉屬及輪枝孢屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。森林土壤真菌群落組成的差異，這既可能是分析鑒定方法的不同，也可能與不同土壤質(zhì)地和植被類型相關(guān)。不同的森林類型由于植被組成不同、土壤養(yǎng)分［22-23］和土壤環(huán)境因子［13,23］存在差異，對(duì)森林土壤微生物群落產(chǎn)生影響［24-25］，導(dǎo)致土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［13,26］。本研究在四種林型土壤理化性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果中除兩種原始紅松林之間除水分含量和總孔隙度差異顯著外，多數(shù)因子差異不顯著，但其他林型之間多數(shù)土壤理化因子差異顯著。

本研究四種林型土壤真菌α多樣性指數(shù)分析表明，原始林（云冷杉紅松林和椴樹紅松林）真菌群落豐富度指數(shù)（Ace和Chao1指數(shù)）高于成熟的紅松人工林和紅松天然次生林，該研究結(jié)果與其他以往的一些研究基本一致。如董愛(ài)榮等［8］采用稀釋平板法和植物殘?jiān)▽?duì)小興安嶺涼水自然保護(hù)區(qū)椴樹紅松林、楓樺紅松林、白樺林、人工落葉松林與人工紅松林等林型的土壤真菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)土壤真菌同森林類型密切相關(guān)，椴樹紅松林和楓樺紅松林土壤真菌數(shù)量和種類明顯多于其他三種林型，這是由于椴樹紅松林和楓樺紅松林林分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，紅松占優(yōu)勢(shì)，闊葉樹種類較多，林下喬灌木、藤本植物以及草本植物種類多，植物多樣性遠(yuǎn)比其他三種林型高［7］。這是因?yàn)樯值蚵湮锖屯寥乐姓婢图?xì)菌群落的組成在很大程度上是由優(yōu)勢(shì)樹木決定的［27］。同樣郭彥萃等［28］采用BIOLOG微平板法，研究發(fā)現(xiàn)小興安嶺涼水國(guó)家自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的原始闊葉紅松林土壤微生物較原始針葉紅松林及人工林土壤微生物具有更豐富的多樣性。但本研究中紅松人工林真菌的豐富度指數(shù)高于天然次生林，這與一些研究結(jié)果有所不同。如Nie等［29］在亞熱帶地區(qū)天然松林與人工林細(xì)菌和真菌群落比較中，天然松林真菌群落的Ace和Chao1指數(shù)高于人工松林。由于森林土壤真菌群落組成還與森林年齡［30］和發(fā)育階段［31］有關(guān)，本研究中人工林選取的紅松年齡都在60年以上，天然次生林中紅松年齡在不足40年，這可能導(dǎo)致了人工林的豐富度指數(shù)高于次生林的原因。

林型不同、樹種不同［32］，土壤真菌所處的微環(huán)境［33］和可利用的凋落物資源的復(fù)雜程度也會(huì)不同［27］，其真菌的群落結(jié)構(gòu)也會(huì)有差異。植物通過(guò)影響土壤環(huán)境［34］，進(jìn)而影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性［13,26］。本研究在四種林型土壤優(yōu)勢(shì)真菌屬與土壤理化因子的CCA分析結(jié)果中pH、水分含量、土壤總孔隙度、總有機(jī)碳和全氮5個(gè)理化因子對(duì)土壤真菌群落有顯著性影響，其中全氮是影響四種林型土壤真菌群落的主要因子，其次為土壤總有機(jī)碳含量。這與優(yōu)勢(shì)真菌屬與土壤理化因子的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果中有所體現(xiàn)，土壤全氮含量與六個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬顯著相關(guān)（與紅菇屬、乳牛肝菌屬和unclassified-f-Thelephoraceae的相對(duì)豐度顯著正相關(guān)，而與馬拉色氏霉菌屬、青霉屬和擬青霉屬顯著負(fù)相關(guān)。其次是有機(jī)碳含量與四個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬顯著相關(guān)（有機(jī)碳含量與紅菇屬、乳牛肝菌屬和unclassified-f-Thelephoraceae的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與馬拉色氏霉菌屬顯著負(fù)相關(guān)）。原始紅松林物理性質(zhì)保持了較好的原始狀態(tài)，含水量較高，土壤通水透氣狀態(tài)良好，土壤肥力較高，為真菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造了良好條件。如原始紅松林土壤中總有機(jī)碳、全氮顯著高于紅松天然次生林，同時(shí)影響微生物活性的總孔隙度和土壤水分含量也顯著高于紅松天然次生林。這可能也揭示了四種林型土壤真菌PCoA和ANOSIM分析結(jié)果：兩種原始紅松林的土壤真菌群落組成相近，差異不顯著，但原始林與人工林和天然次生林型之間差異顯著。本研究獲得的四種林型紅松林土壤真菌群落組成和多樣性特征，將為原始紅松林的保護(hù)和人工恢復(fù)提供依據(jù)，同時(shí)優(yōu)勢(shì)真菌屬與土壤土壤理化因子的相關(guān)性分析結(jié)果具有一定的實(shí)踐意義，這將為紅松林土壤真菌資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。此另外在四種林型中檢測(cè)出大量未被鑒定的真菌ITS序列，這些序列還需要進(jìn)一步的鑒定分析。

4 結(jié) 論

四種林型紅松林土壤真菌群落優(yōu)勢(shì)菌為子囊菌門和擔(dān)子菌門。在考慮真菌物種豐度和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化距離的情況下，四種林型紅松林土壤真菌群落組成差異顯著，但兩種原始紅松林和紅松人工林與天然次生林之間群落組成無(wú)顯著差異。原始紅松林土壤理化性質(zhì)優(yōu)于紅松人工林和紅松天然次生林，導(dǎo)致土壤真菌群落豐富度高于紅松人工林和紅松天然次生林，其中土壤全氮、總有機(jī)碳、pH、水分含量和總孔隙度是顯著影響四種林型土壤真菌群落組成的環(huán)境因子。