陳裕新 呂昆明 周偉東

摘要 ? ?本文研究了含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料中脂肪酶和淀粉酶的活性，以及對柑橘紅蜘蛛的田間防治效果。結(jié)果表明，含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料的脂肪酶活性和淀粉酶活性分別達到3.77、18.14 U/g，酶活力沒有因肥料高鹽環(huán)境而失活，仍具有較高的生物活性;施后1、3、7、20 d，含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料100、150、200倍液處理都表現(xiàn)出很好的防治柑橘紅蜘蛛的效果，都顯著高于110 g/L乙螨唑懸浮劑4 400倍液處理和不添加解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料100倍液處理;含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料200倍液處理噴后1 d防治效果達到90.28%，噴后20d防治效果達到了97.39%，表現(xiàn)出了良好的速效性和持效性。

關(guān)鍵詞 ? ?解淀粉芽孢桿菌;復合微生物肥料;柑橘紅蜘蛛;防治效果

中圖分類號 ? ?S436.611.2+9 ? ? ? ? 文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）18-0070-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?The activity of lipase and amylase in compound microbial fertilizer containing Bacillus amyloliquefaciens LTBA02 was measured，and the field control effect of the fertilizer on Panonychus citri McGregor was studied.The results showed that the lipase activity and amylase activity of the composite microbial fertilizer containing Bacillus amyloliquefaciens LTBA02 reached 3.77 U/g and 18.14 U/g，respectively.The enzyme activity was not inactivated due to the high salt environment of the fertilizer，and it still had a high biological activity.1，3，7，20 d after application，100，150，200 times solution of compound microbial fertilizer containing Bacillus amyloliquefaciens LTBA02 showed good effect of controlling Panonychus citri McGregor，which was significantly higher than 110 g/L etoxazole flowable agent 4 400 times treatment and 100 times solution treatment of the composite microbial fertilizer without adding Bacillus amyloliquefaciens LTBA02.The control effect of 200 times solution treatment of compound microbial fertilizer containing B.amyloliquefaciens LTBA02 ?reached 90.28% after spraying 1 d，the control effect of that reached 97.39% after spraying 20 days，showed good quick-acting and long-lasting effect.

Key words ? ?Bacillus amyloliquefaciens;compound microbial fertilizer;Panonychus citri McGregor;control effect

解淀粉芽孢桿菌是一種好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，在自然界中分布廣泛，可在土壤、植物根際體表、深海水中、植物體內(nèi)等環(huán)境中存在。解淀粉芽孢桿菌在生長過程中可以產(chǎn)生一系列能夠抑制動植物和微生物生長的代謝產(chǎn)物，因而其具有生物除污、植物促生及生物防治等特性[1]。由于解淀粉芽孢桿菌具有高效性，且對環(huán)境無殘留危害，從而引起了國內(nèi)外廣大科技工作者的重視。已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌具有分泌解淀粉酶、蛋白酶、凝乳酶、植酸酶、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、脂肪酶等胞外酶以及表面活性素、芬薺素、伊枯草菌素和桿菌抗霉素等抗生素、抗菌蛋白質(zhì)多肽類代謝產(chǎn)物的能力[2]，因而被廣泛應用在環(huán)境保護、農(nóng)作物病蟲害防治[3]和動物養(yǎng)殖[4]等方面。

解淀粉芽孢桿菌LTBA02菌株是廣西樂土生物科技有限公司從環(huán)境中分離純化得到，并于2018年7月備案中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢），保藏編號CCTCC NO：M20184

33。研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌LTBA02菌株具有較強的分解脂肪酶和淀粉酶能力，能酶解柑橘紅蜘蛛表皮蠟質(zhì)，造成紅蜘蛛閉吸或死亡[5]。

根據(jù)菌株具有酶解柑橘紅蜘蛛表皮蠟質(zhì)，造成紅蜘蛛閉吸或死亡的特性，擬將其添加到復合微生物肥料產(chǎn)品中，開發(fā)成具有生物防治柑橘紅蜘蛛的特種肥料。本研究旨在驗證含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料對柑橘紅蜘蛛是否有防治效果，研究該產(chǎn)品的使用方法，為該產(chǎn)品的開發(fā)和推廣應用提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗地概況

試驗地選在南寧市武鳴區(qū)雙橋鎮(zhèn)造慶村柑橘園，柑橘樹齡3年，田間柑橘樹長勢均勻，肥水管理一致，種植規(guī)格2.5 m×3.0 m，施藥時田間柑橘紅蜘蛛成、若螨共存。試驗前10 d及試驗期間未對其他非靶標生物進行施藥防治。試驗區(qū)土壤為砂質(zhì)壤土，有機質(zhì)含量中等。

1.2 ? ?試驗材料

供試肥料和藥劑為含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料（由廣西樂土生物科技有限公司配制，有效活菌數(shù)≥0.2億個/g，N+P2O5+K2O≥25%，有機質(zhì)≥20%，粉劑，全水溶）;不添加解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料產(chǎn)品（由廣西樂土生物科技有限公司配制，N+P2O5+K2O≥25%，有機質(zhì)≥20%，粉劑，全水溶）;110 g/L乙螨唑懸浮劑（日本住友化學株式會社產(chǎn)品，登記證號：PD20120215）。供試作物為柑橘（沃柑）。防治對象為柑橘紅蜘蛛。

1.3 ? ?試驗設(shè)計

試驗設(shè)6個處理，即施用含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料100倍液（A）、150倍液（B）、200倍液（C），不添加解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料100倍液（D），110 g/L乙螨唑懸浮劑4 400倍液（有效成分含量為25 mg/kg）（E），以清水作對照（CK）。3次重復，隨機區(qū)組排列。每個小區(qū)3株柑橘。

1.4 ? ?施藥方法

采用背負式電動噴霧器噴霧，供試藥物用清水稀釋后，對柑橘植株葉片正、反面進行均勻噴霧;空白對照區(qū)噴等量清水。2018年8月9日，柑橘紅蜘蛛發(fā)生高峰前期施藥（紅蜘蛛種群數(shù)為5～8頭/葉），試驗期間施1次藥。每株噴藥液1.5 L，折合噴藥液1 800 L/hm2。試驗期間未使用殺蟲劑。

1.5 ? ?試驗期間氣象資料

施藥當天晴間多云，日均溫度30.4 ℃，東南風0～1級，施藥后2 d無雨;試驗期間降雨天數(shù)8 d，累計降雨量90.7 mm，其中大雨2次;平均氣溫29.7 ℃，最高36.7 ℃，最低23 ℃。

1.6 ? ?測定指標

1.6.1 ? ?含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料產(chǎn)品中脂肪酶活性的測定。

（1）藥品配制和待測樣品液的制備。①底物溶液：精確稱取聚乙烯醇（聚合度1 750±50）40 g，加水800 mL，在沸水浴中加熱，攪拌，直至全部溶解，冷卻后定容至1 000 mL，用干凈的雙層紗布過濾，取濾液備用。量取上述濾液150 mL，加橄欖油50 mL，用高速勻漿機處理6 min（分2次處理，間隔5 min，每次處理3 min），即得配制好的底物溶液。該溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配。②磷酸緩沖液：分別稱取磷酸二氫鉀1.96 g和十二水磷酸氫二鈉39.62 g，用水溶解并定容至500 mL，配好后應以酸度計校正pH值到7.5。③氫氧化鈉標準溶液：按GB/T 601配制與標定，制備成 0.05 mol/L氫氧化鈉標準溶液。④待測樣品液：稱取待測樣品1～2 g，用磷酸緩沖液溶解并稀釋。測定時控制待測樣品液濃度，樣品與對照消耗堿量之差控制在1～2 mL范圍內(nèi)。

（2）脂肪酶活力的檢測分析。取2個100 mL三角瓶，分別作為空白A和樣品B，分別加入底物溶液4 mL和磷酸緩沖液5 mL，再于A中加入95%酒精15 mL，于（40.0±0.2）℃水浴鍋中預熱5 min，然后各加1 mL待測樣品液，立即混勻計時，準確反應15 min后，于B中立即補加15 mL 95%酒精終止反應，取出。于A、B瓶中各加入酚酞指示液2滴，用0.05 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定，直至微紅色并保持30 s不褪色為滴定終點，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積。

（3）酶活力計算。1 g固體樣品在40 ℃和pH值7.5條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol的可滴定的脂肪酸，即為1個酶活力單位，以U/g表示。計算公式：

式中：X—樣品脂肪酶活力，單位為U/g;V1—滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，單位為mL;V2—滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，單位為mL;C—氫氧化鈉標準溶液，單位為mol/L;50—0.05 mol/L氫氧化鈉溶液1.00 mL相當于脂肪酸50 μmol;n—樣品的稀釋倍數(shù);0.05—氫氧化鈉標準溶液濃度換算系數(shù);15—反應時間15 min，以1 min計算。

1.6.2 ? ?含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料產(chǎn)品中淀粉酶活性的測定。

（1）藥品配制和待測樣品液的制備。①稀碘液：稱取結(jié)晶碘11 g、碘化鉀22 g，先用少量蒸餾水使碘完全溶解后，再加蒸餾水定容至500 mL，即得原碘液;取原碘液2 mL，加碘化鉀20 g，加蒸餾水溶解定容至500 mL，即得稀碘液，貯于棕色瓶內(nèi)備用。②2%可溶性淀粉：稱取2 g可溶性淀粉，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩慢加入70 mL沸水中，然后用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻定容至100 mL。現(xiàn)配現(xiàn)用。③磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液：稱取十二水磷酸氫二鈉45.23 g和檸檬酸8.07 g，用蒸餾水溶解定容至1 000 mL，配好后應以酸度計校正pH值為6.0。④待測樣品液：稱取待測樣品1～2 g，先用少量40 ℃的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液溶解，并用玻璃棒搗碎，將上層清液小心傾入適當?shù)娜萘科恐?，沉渣部分再加入少量上述緩沖溶液，如此反復研搗3～4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖溶液定容至刻度，搖勻，通過4層紗布過濾，再用濾紙濾清，濾液供測定用。

（2）淀粉酶活力的檢測分析。于白瓷板空穴內(nèi)滴入稀碘液1.5 mL。取2%可溶性淀粉20 mL和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5 mL于25 mm×200 mm試管中，于60 ℃恒溫水溶中預熱4～5 min。隨后加入預先稀釋好的待測樣品液0.5 mL，立即計時，充分搖勻，定時用吸管取出反應液0.5 mL，滴于預先滴有稀碘液的瓷板穴內(nèi)，當穴內(nèi)顏色由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色，即為反應終點，記錄時間。酶反應全部時間控制在2.0～2.5 min范圍內(nèi)，測定時照明采用日光燈。

（3）酶活力計算。1 g固體樣品在60 ℃和pH 值6.0條件下，1 h降解1 g可溶性淀粉，即為1個酶活力單位，以U/g表示。計算公式：

其中：W—樣品淀粉酶活性，單位為U/g;T—測定時間，單位為min;60—60 min;20—吸取可溶性淀粉的體積，單位為mL;2%—可溶性淀粉溶液濃度;n—待測樣品稀釋倍數(shù);0.5—測定時稀酶液吸取量，單位為mL。

1.6.3 ? ?含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料產(chǎn)品田間防治柑橘紅蜘蛛效果。噴藥前進行螨口基數(shù)調(diào)查，藥后1、3、7、20 d調(diào)查活螨數(shù)。試驗期間共調(diào)查5次。調(diào)查方法為每小區(qū)定株調(diào)查2株，在植株的4個方位標記嫩梢，每梢查葉片5片，每株調(diào)查20片葉的存活螨數(shù);與CK比較，計算相對防效。藥效計算公式如下：

式中：CK0為對照區(qū)藥前活螨數(shù);CK1為對照區(qū)藥后活螨數(shù);PT0為處理區(qū)藥前活螨數(shù);PT1為處理區(qū)藥后活螨數(shù)。

1.7 ? ?數(shù)據(jù)處理

防效方差分析采用DPSv 6.55版專業(yè)軟件按DMRT法進行處理。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料產(chǎn)品中脂肪酶和淀粉酶活性分析

添加有含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料，其脂肪酶活性和淀粉酶活性仍保持較高酶活，分別達到3.77 、18.14 U/g;不添加解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料脂肪酶活性和淀粉酶活性分別為0.25、0.44 U/g，雖能檢測出部分酶活力，但相對供試產(chǎn)品相差甚遠。這說明解淀粉芽孢桿菌LTBA02菌株在肥料中仍具有較高的生物活性，其酶活沒有因肥料高鹽環(huán)境而失活。

2.2 ? ?含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料產(chǎn)品田間防治柑橘紅蜘蛛效果分析

從表1可知，處理A、B、C藥后1、3、7、20 d都表現(xiàn)出很好的防效;其中處理C藥后1 d防治效果達到90.28%，藥后20 d防治效果達到了97.39%，表現(xiàn)出了良好的速效性和持效性。處理D隨時間推移防效逐漸降低，藥后20 d防治效果僅為12.39%，這說明了解淀粉芽孢桿菌LTBA02在防治柑橘紅蜘蛛中起到了關(guān)鍵性的作用。在試驗濃度下，供試產(chǎn)品對柑橘安全，未發(fā)現(xiàn)藥害。

方差分析可知，處理A、B、C藥后1、3、7、20 d的防效隨藥劑使用濃度提高而有所提高，但差異均不顯著。處理A、B、C的防效均極顯著高于處理E和處理D。

3 ? ?結(jié)論與討論

酶活檢測結(jié)果表明，添加有含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料，其脂肪酶活性和淀粉酶活性仍保持較高的酶活，脂肪酶活性和淀粉酶活性比不添加解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料高。這說明解淀粉芽孢桿菌LTBA02菌株在肥料中仍具有較高的生物活性，其酶活沒有因肥料高鹽環(huán)境而失活。高鹽狀態(tài)下普通酶的空間結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，酶活性以及酶的作用位點都可能發(fā)生改變[6-7]，但供試產(chǎn)品中，其酶活并未因肥料中的高鹽成分影響而失活，這可能在酶活檢測中或產(chǎn)品使用中，需要將樣品進行兌水溶解并稀釋，而高鹽使酶活性失活是一種可逆暫時性失活，當外部鹽度降低后，酶活性逐漸恢復。

田間藥效試驗結(jié)果表明，不添加解淀粉芽孢桿菌LTB-A02的復合微生物肥料，在一定使用濃度下也能對柑橘紅蜘蛛造成傷害，形成一定防效。但含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料防治柑橘紅蜘蛛在速效性和持久性方面都顯著優(yōu)于不添加解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料，說明解淀粉芽孢桿菌LTBA02菌株的生物活性成分在防治柑橘紅蜘蛛上具有關(guān)鍵性作用。這可能是在噴施過程中，肥料中氮磷鉀鹽分首先對柑橘紅蜘蛛造成高鹽傷害，這種傷害是接觸性物理傷害，其后解淀粉芽孢桿菌LTBA02菌株的生物活性成分脂肪酶、解淀粉酶進一步加速傷口的破壞，使其無法恢復，造成柑橘紅蜘蛛死亡。肥料中的高鹽和解淀粉芽孢桿菌LTBA02的生物活性成分的交叉作用，才形成了供試產(chǎn)品在防治柑橘紅蜘蛛方面良好的速效性和持久性。

含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料產(chǎn)品對防治柑橘紅蜘蛛具有顯著效果，其100倍液、150倍液、200倍液處理的使用效果都顯著優(yōu)于對照藥劑110 g/L乙螨唑懸浮劑4 400倍液（有效成分含量25 mg/kg）處理的防效，并且具有良好的速效性和持久性。在試驗濃度下，含解淀粉芽孢桿菌LTBA02的復合微生物肥料對柑橘安全，未發(fā)現(xiàn)藥害。綜合防治效果和使用成本，推薦使用濃度為150～200倍液。

4 ? ?參考文獻

[1] 陳哲，黃靜，趙佳，等.解淀粉芽孢桿菌抑菌機制的研究進展[J].生物技術(shù)通報，2015，31（6）：37-41.

[2] 出曉銘，林毅雄，張砷，等.生防菌解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的研究進展[J].包裝與食品機械，2014，32（6）：49-54.

[3] 蔣昐昐，陳志誼，甘穎，等.解淀粉芽孢桿菌B1619對設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲病的防治效果[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（12）：81-84.

[4] 王美玲，吳駿晨，朱赟程，等.解淀粉芽孢桿菌在動物生產(chǎn)中應用的研究進展[J].中國畜牧雜志，2017，53（2）：19-23.

[5] 廖華，呂昆明.一種解淀粉芽孢桿菌菌株及其篩選方法：中國，201811038216.1[P].2018-09-06.

[6] 柳旭東，張利民，王際英，等.鹽度對水產(chǎn)動物組織中酶活力的影響[J].養(yǎng)殖與飼料，2008（11）：68-71.

[7] 許星鴻，朱曉瑩，闕義進，等.pH、溫度和鹽度對單環(huán)刺消化酶和溶菌酶活力的影響[J].水產(chǎn)科學，2017，36（2）：138-142.