羅 磊 關(guān)寧寧 向進(jìn)樂(lè) 朱文學(xué)

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023； 2. 河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023)

牡丹是中國(guó)最重要的觀賞花卉之一，同時(shí)具有較高的食用價(jià)值，自古就有牡丹花茶、牡丹花酒和牡丹花脯等產(chǎn)品，2011年3月衛(wèi)生部認(rèn)定鳳丹牡丹為新資源食品[1]。牡丹花蕊是牡丹花的精華部分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，周明遠(yuǎn)等[2]研究表明牡丹花蕊可提取牡丹花蕊油，其中亞油酸和亞麻酸含量遠(yuǎn)高于其他常見(jiàn)食用油。李朝蘋等[3]研究表明牡丹花蕊水體液在體外具有較強(qiáng)的抗氧化性。但是目前對(duì)牡丹花蕊醇提物抗氧化作用及主要功效成分缺乏深入研究。

血管內(nèi)皮細(xì)胞參與機(jī)體免疫活動(dòng)，其損傷與動(dòng)脈粥樣硬化[4]、腦卒中、高血壓[5]、冠心病和糖尿病[6-7]等疾病的發(fā)生發(fā)展有著緊密的關(guān)系。而氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞損傷的重要因素之一，所以采用H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞是研究抗氧化作用的重要手段之一[8-10]。傅茂潤(rùn)等[11]對(duì)牡丹花蕊進(jìn)行了提取工藝研究，李朝蘋等[3]研究了牡丹花蕊提取液的體外抗氧化功效，但關(guān)于牡丹花蕊提取物在細(xì)胞水平上的功效研究卻鮮有報(bào)道。試驗(yàn)擬在高效液相分析其功效成分的基礎(chǔ)上，采用H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC細(xì)胞)損傷來(lái)檢測(cè)牡丹花蕊醇提物在細(xì)胞中抗氧化作用，以期為牡丹在牡丹花蕊方向上的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹花：品種為鳳丹白，采摘地點(diǎn)為洛陽(yáng)洛龍區(qū)牡丹園；

蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素、芍藥苷和木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品：純度均≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：上海名勁科技有限公司；

高糖培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone公司；

噻唑藍(lán)：美國(guó)Sigma公司；

雙抗、胰蛋白酶(250 NFU/mg)：美國(guó)Gibco公司；

四季青胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；

纖維素酶：50 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；

SOD、GPX、MDA、GSH和BCA測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：1260Infinity型，安捷倫科技有限公司；

雙人單面凈化工作臺(tái)：SW-CJ-2FD型，濟(jì)南啟科儀器設(shè)備有限公司；

倒置顯微鏡：CKX41型，日本Olympus公司；

全自動(dòng)酶標(biāo)儀：680型，美國(guó)Bio-Rad公司；

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：E191IR型，美國(guó)金西盟公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，南京曉曉儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牡丹花蕊醇提物的制備 采用纖維素酶—超聲輔助乙醇提取法，條件：乙醇濃度70%，料液比1∶40 (g/mL)，加酶量0.3%，酶解pH 5，酶解時(shí)間30 min，50 ℃ 條件下酶解后沸水浴10 min滅活，超聲功率300 W，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度45 ℃，提取后旋蒸濃縮。牡丹花蕊提取液配置成濃度為2.0 mg/mL的上樣液，以1.50 mL/min 上樣流速進(jìn)行D-101樹(shù)脂的吸附過(guò)程，先以3.0 BV的蒸餾水以1.5 mL/min流速洗脫除雜，再以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液以3.0 mL/min流速洗脫，收集乙醇洗脫液，旋蒸(溫度60 ℃)至總體積的5%，真空冷凍干燥(溫度約-40 ℃，冷凍時(shí)間24 h)后置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 牡丹花蕊醇提物的紫外光譜掃描 稱取凍干后的牡丹花蕊醇提物粉末5 mg，用70%無(wú)水乙醇定容至100 mL，在波長(zhǎng)200～700 nm的范圍內(nèi)，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.3 牡丹花蕊醇提物的高效液相色譜分析

(1) 色譜條件：采用Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱進(jìn)行分析，以乙腈(A)和水(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，0～30 min，30% A→60% A，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

(2) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：參考有關(guān)牡丹相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，試驗(yàn)選擇6種主要的標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，即蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素、芍藥苷和木犀草素。參考王金艷等[14]的方法稍作修改，配置標(biāo)準(zhǔn)混合溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3) 稱取牡丹花蕊醇提物粉末4 mg，甲醇溶液定容至10 mL，超聲5 min后過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，按1.3.3(1)的色譜條件進(jìn)行分析。

1.3.4 牡丹花蕊醇提物的細(xì)胞試驗(yàn)

(1) HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)：參考劉竹青等[15]的方法配置DMEM培養(yǎng)基，在CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，并定時(shí)更換培養(yǎng)液。

(2) HUVEC氧化損傷模型的建立：參考羅磊等[16]的方法并稍作調(diào)整，將細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)/mL的HUVEC細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。配置不同濃度梯度的H2O2溶液(0～1 mmol/L)作用于HUVEC細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。依據(jù)式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

(1)

式中：

A——細(xì)胞存活率，%；

A0——空白組的吸光度均值；

A1——不同濃度H2O2組的吸光度均值。

(3) 藥物濃度劑量的篩選：篩選過(guò)程同氧化損傷模型建立過(guò)程相似，配置不同濃度的牡丹花蕊醇提物培養(yǎng)液(0～1 mg/L)作用于HUVEC細(xì)胞，采用MTT法[17]檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

(4) HUVEC細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶的測(cè)定：參考卞夢(mèng)瑤等[17]的方法并稍作調(diào)整，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2.0 mL，培養(yǎng)24 h貼壁后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液?？瞻捉M和模型組加入2.0 mL培養(yǎng)基；低、中、高組分別加入2.0 mL不同質(zhì)量濃度的牡丹花蕊醇提液(100，300，500 μg/mL)；對(duì)照組加入2.0 mL濃度為500 mg/mL的 VC培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后吸棄上清液，每孔加入800 mmol/L 的H2O2溶液2.0 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后將細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液分離。參照SOD、GPX、GSH、MDA和BCA試劑盒的操作說(shuō)明，以BCA試劑盒檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，測(cè)定細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD和GPX活性以及GSH和MDA的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹花蕊醇提物的成分分析

2.1.1 紫外光譜掃描結(jié)果 大多數(shù)黃酮類化合物的紫外吸收光譜中有兩個(gè)特征吸收峰帶，300～400 nm的吸收帶為帶Ⅰ，240～280 nm的吸收帶為帶Ⅱ[18]。如圖1所示，牡丹花蕊醇提物溶液經(jīng)過(guò)紫外光譜掃描之后在277 nm處出現(xiàn)了特征峰帶Ⅱ，在365 nm處出現(xiàn)了特征峰帶Ⅰ。說(shuō)明牡丹花蕊醇提物的紫外光譜掃描結(jié)果符合黃酮類化合物的特征光譜反應(yīng)。

圖1 牡丹花蕊醇提物的紫外可見(jiàn)吸收光譜

2.1.2 HPLC分析 表1為6種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且在0.05～0.40 mg/mL時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。圖2為黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與牡丹花蕊醇提物溶液的HPLC圖。圖2(b)中出現(xiàn)的3個(gè)較為明顯的色譜峰，分別為峰1、峰2和峰4，且與圖2(a)中的峰1、峰2和峰4相對(duì)應(yīng)，保留時(shí)間基本相同。圖2(b)中保留時(shí)間在7.31 min 的峰以及保留時(shí)間在11.66 min的峰在圖2(a)中無(wú)對(duì)應(yīng)保留時(shí)間的峰。經(jīng)分析，牡丹花蕊醇提物中主要含有蘆丁、槲皮素和芍藥苷3種單體，且含量分別為44.25%，17.00%，15.50%，所以純化后的牡丹花蕊醇提物的濃度約為76.75%。

表1 6種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 牡丹花蕊醇提物的細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)

2.2.1 H2O2濃度的篩選 由圖3可知，H2O2濃度在0～600 μmol/L時(shí)，對(duì)HUVEC 無(wú)明顯的抑制作用(P>0.05)。當(dāng)H2O2濃度為800 μmol/L時(shí)，HUVEC細(xì)胞存活率為52.05%。H2O2濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)量死亡，而濃度過(guò)低又會(huì)因細(xì)胞代數(shù)不同等因素而不能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，故H2O2濃度選擇800 μmol/L 為宜。

1. 蘆丁 2. 芍藥苷 3. 木犀草素 4. 槲皮素 5. 芹菜素 6. 山奈酚

圖2 混合黃酮標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC圖

Figure 2 HPLC chromatogram of the mixture of flavone standards and sample

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

2.2.2 牡丹花蕊醇提物濃度選擇 如圖4所示，濃度在100～500 μg/mL時(shí)牡丹花蕊醇提物對(duì)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響(P>0.05)。濃度>500 μg/mL時(shí)，顯著抑制增殖(P<0.05)。研究[19]表明當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)會(huì)增加動(dòng)脈硬化的可能性，所以，選擇牡丹花蕊醇提物劑量為100，300，500 μg/mL來(lái)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與血管生成關(guān)系密切，所以抑制血管生成是研究抗腫瘤的重要機(jī)制之一。圖4表明，當(dāng)牡丹花蕊醇提物濃度>500 μg/mL時(shí)對(duì)HUVEC細(xì)胞有抑制作用，說(shuō)明牡丹花蕊醇提物中可能含有某種血管生成抑制因子。

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

2.2.3 牡丹花蕊醇提物對(duì)HUVEC細(xì)胞及培養(yǎng)液中SOD活性的影響 超氧化物歧化酶是機(jī)體內(nèi)重要的自由基清除劑，能夠清除胞內(nèi)過(guò)量ROS從而維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性[20]。圖5表明，細(xì)胞中模型組SOD含量為156.5 U/mg，劑量組SOD含量均顯著提高(P<0.05)，均在200.0 U/mg以上。說(shuō)明當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的自由基含量增加，SOD含量下降，而牡丹花蕊醇提物能夠提高細(xì)胞抗自由基攻擊的能力，提高細(xì)胞內(nèi)SOD水平。

高劑量組含量為269.5 U/mg，對(duì)照組含量為275.9 U/mg，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明高劑量的牡丹花蕊醇提物的抗氧化性可達(dá)到VC水平。細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD含量變化與細(xì)胞一致，中、低劑量組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

2.2.4 牡丹花蕊醇提物對(duì)HUVEC細(xì)胞及培養(yǎng)液中GSH含量的影響 谷胱甘肽能夠清除O2-和H2O2，能夠與自由基等有害物質(zhì)相結(jié)合轉(zhuǎn)為無(wú)害物質(zhì)排出體外，減少機(jī)體氧化損傷[21]。圖6表明，細(xì)胞中模型組的濃度為5.90 mg/g，劑量組GSH含量分別為10.70，21.01，36.80 mg/g，含量顯著升高。說(shuō)明牡丹花蕊醇提物能夠提高細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，從而降低自由基的含量，避免細(xì)胞損傷。高劑量組的GSH含量與對(duì)照組相比，差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明高劑量的牡丹花蕊醇提物在細(xì)胞內(nèi)具有很強(qiáng)的抗氧化性。培養(yǎng)液與細(xì)胞中GSH的含量變化一致，細(xì)胞及培養(yǎng)液中的低、中、高劑量組間均有顯著差異，說(shuō)明抗氧化能力與濃度存在劑量依賴效應(yīng)。

2.2.5 牡丹花蕊醇提物對(duì)HUVEC細(xì)胞及培養(yǎng)液中GPX活性的影響 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是一種能夠催化H2O2分解的酶，將H2O2還原成水，而自身轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽，而氧化型谷胱甘肽可以在還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為GSH，GSH通過(guò)清除過(guò)量的自由基來(lái)維持細(xì)胞活性[22-23]。如圖7所示，細(xì)胞中牡丹花蕊醇提物組將模型組中GPX的含量從57.79 mg/L提高到了150.00 mg/L 以上，培養(yǎng)液中，GPX的含量從6.90 mg/L提高到了15.00 mg/L 以上，差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明牡丹花蕊醇提物能夠提高細(xì)胞內(nèi)GPX的活性，使其催化H2O2水解，增加GSH含量，提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激的能力。劑量組中GPX的活性變化也表明花蕊醇提物的抗氧化能力與濃度存在劑量依賴效應(yīng)。培養(yǎng)液中GPX的含量與細(xì)胞中含量變化一致。

小寫不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

2.2.6 牡丹花蕊醇提物對(duì)HUVEC細(xì)胞及培養(yǎng)液中MDA含量的影響 不飽和脂肪酸因自由基攻擊發(fā)生氧化，機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛就會(huì)升高，丙二醛的存在會(huì)加速細(xì)胞膜的衰老[24-25]。如圖8所示，細(xì)胞中模型組的MDA含量為32.38 mol/mg，遠(yuǎn)高于空白組的5.93 mol/mg，說(shuō)明當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增多，細(xì)胞膜的功能性降低。與模型組相比，低、中、高劑量組顯著抑制了H2O2引起的MDA含量的增加(P<0.05)，說(shuō)明牡丹花蕊醇提物能夠清除自由基，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生。高劑量組的MDA含量低于對(duì)照組的，說(shuō)明高劑量的牡丹花蕊醇提物對(duì)于降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量的作用，可能高于抗壞血酸。細(xì)胞液中MDA含量變化與細(xì)胞中MDA含量變化一致。

周艷峰等[26]研究表明，蘆丁在對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，主要與減少ROS的生成有關(guān)，其中SOD、MDA和GSH的變化情況與試驗(yàn)一致。宋獻(xiàn)美等[27]研究表明芍藥苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC損傷具有明顯的保護(hù)作用，可通過(guò)抑制HUVEC細(xì)胞間黏附因子ICAM-1的表達(dá)[28]，從而抑制細(xì)胞損傷。Shokoohinia等[29]和 Daubney等[30]研究表明槲皮素可通過(guò)減少ROS的形成來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞PC12和心肌細(xì)胞H9c2。褚韋韋等[31]研究表明槲皮素夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的還原系統(tǒng)，增加GPX1、SOD2及GSH的水平，降低氧化應(yīng)激所帶來(lái)的損傷。而試驗(yàn)結(jié)果表明，牡丹花蕊醇提物主要成分為蘆丁、槲皮素和芍藥苷，含量分別達(dá)到44.25%，15.50%，17.00%，總含量為76.75%。蘆丁、槲皮素和芍藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD和GPX等抗氧化物酶活性的提高和對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，與牡丹花蕊醇提物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制一致，因此，蘆丁、槲皮素和芍藥苷可能是牡丹花蕊醇提物產(chǎn)生較強(qiáng)抗氧化作用的主要成分。

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)表明，H2O2能夠造成細(xì)胞膜的損傷，對(duì)HUVEC細(xì)胞中的SOD和GPX等抗氧化物酶活性具有抑制作用，造成脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量上升，GSH含量下降。當(dāng)不同濃度的牡丹花蕊醇提物作用于HUVEC細(xì)胞后，細(xì)胞中SOD和GPX活性以及GSH的含量均有不同程度的提高，而且細(xì)胞中MDA含量也顯著降低。說(shuō)明牡丹花蕊醇提物能夠提高細(xì)胞中各種抗氧化物酶的活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生，保護(hù)HUVEC細(xì)胞完整且提高細(xì)胞抗氧化性。這一結(jié)論與馬靜靜等[25]的研究結(jié)論一致，說(shuō)明通過(guò)抑制細(xì)胞間黏附因子的表達(dá)可能也是牡丹花蕊醇提物其發(fā)揮抗氧化性的途徑之一。

牡丹花蕊醇提物純化后主要所含蘆丁、槲皮素和芍藥苷3種單體，三者可能是牡丹花蕊醇提物產(chǎn)生較強(qiáng)抗氧化作用的主要成分，但3種單體成分發(fā)揮抗氧化作用的主要機(jī)制和途徑卻尚不清楚。牡丹花蕊中3種單體成分的分離純化及其功效研究將是下一步的研究方向。