鐘宜科 王永霞 趙 彤 賀曉明郭建樹(shù) 劉 威 鄒大陽(yáng)

(1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038； 2. 中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京 100000)

近20年，食源性疾病的發(fā)病率明顯增加，已成為全球主要的公共問(wèn)題之一[1]，而腹瀉病占全球食源性疾病50%以上[2]。大腸桿菌為主要致病性細(xì)菌之一[3]，根據(jù)致病機(jī)制及臨床表現(xiàn)，常見(jiàn)的致腹瀉大腸桿菌有5類：腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveE.coli，EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicE.coli， EHEC)和腸黏附性大腸桿菌(EnteroaggregativeE.coli， EAEC)[4]。

傳統(tǒng)的病菌檢測(cè)方法操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)；免疫學(xué)檢測(cè)方法靈敏性不足，易造成假陰性。由于多重實(shí)時(shí)SYBR Green PCR由多種不同引物混合，很難克服多種引物間的相互干擾及引物二聚體的形成，使得反應(yīng)體系擴(kuò)增效率不均衡，穩(wěn)定性差，造成結(jié)果不準(zhǔn)確。而HAND系統(tǒng)，即相同標(biāo)簽輔助無(wú)引物二聚體系統(tǒng)(Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，HANDS)[5]，是為了消除和減少引物二聚體的產(chǎn)生而設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法，以此提高檢測(cè)結(jié)果的特異性[6]。

試驗(yàn)擬通過(guò)HAND系統(tǒng)設(shè)計(jì)一種同源加尾引物在一管內(nèi)能夠同時(shí)檢測(cè)5種大腸桿菌，可有效減少反應(yīng)中二聚體及非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 引物

詳見(jiàn)表1、2。

1.1.2 試劑

乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

引物：生工生物工程(上海)股份有限公司；

預(yù)混SuperReal PreMix Plus(2×)、雙蒸水、瓊脂糖、D2000 DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和糞便基因組DNA提取試劑盒購(gòu)：天根生化科技(北京)有限公司；

10 000× Gelred：美國(guó)Biotium公司；

表1 普通引物

表2 加尾引物及多重實(shí)時(shí)PCR溶解曲線Tm值?

? F. 正向引物；R. 反向引物。

10×loading buffer：寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；

營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀：CFX384型，美國(guó)伯樂(lè)公司；

凝膠成像：GelDoc XR Biorad型，美國(guó)伯樂(lè)公司；

熒光計(jì)：Invitroge Qubit 3型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；

生物安全柜：1300系列Ⅱ級(jí)A2型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；

小型臺(tái)式離心機(jī)：5424型，德國(guó)Eppendorf公司；

渦旋振蕩器：VORTEX-5型，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將甘油保存的菌株，劃線于NA培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑取單菌落，接種于5 mL NB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.2 DNA模板制備 取1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)液2 mL，離心取沉淀；向菌體沉淀中分別加入200 μL GA、20 μL ProteinaseK、220 μL GB，振蕩，70 ℃放置10 min；加220 μL無(wú)水乙醇振蕩混勻；將細(xì)菌培養(yǎng)液離心所得溶液及絮狀沉淀加入吸附柱中，離心，倒掉廢液；向吸附柱中加入500 μL GD，離心，倒掉廢液；向吸附柱中加入600 μL PW，離心，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈離心管中，向吸附膜滴加100 μL TE，離心，將溶液收集到離心管中，利用Invitrogen Qubit 3熒光計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定，然后稀釋凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單重實(shí)時(shí)PCR的建立 最終反應(yīng)體系和反應(yīng)程序：?jiǎn)沃貙?shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系(20 μL)為2×SYBR Green Mix 10 μL，尾巴引物(10 μmol/L)2 μL、上下游加尾引物(10 μmol/L)各0.1 μL，模板2 μL，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL；PCR循環(huán)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性10 min后；95 ℃ 10 s、58 ℃ 1 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；溶解曲線溫度65～95 ℃，間隔0.5 ℃，每5 s讀數(shù)。

1.2.4 多重實(shí)時(shí)PCR建立 反應(yīng)體系見(jiàn)表3，為了證明加尾系統(tǒng)能有效減少二聚體和非特異性擴(kuò)增，同時(shí)利用普通引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系見(jiàn)表4，兩種擴(kuò)增程序同1.2.3，瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比擴(kuò)增產(chǎn)物。考慮到實(shí)際疫情爆發(fā)時(shí)，樣本中通常只有一種病原，而同一反應(yīng)體系中出現(xiàn)多種擴(kuò)增靶序列時(shí)，溶解曲線表現(xiàn)為多個(gè)連續(xù)的波峰，不利于結(jié)果判斷，故每種反應(yīng)體系只加入一種菌株DNA模板。

表3 加尾引物反應(yīng)體系

表4 普通引物反應(yīng)體系

1.2.5 多重PCR的特異性 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的17株種屬關(guān)系較近的菌進(jìn)行檢測(cè)，DNA提取同1.2.2，PCR體系同1.2.4，PCR反應(yīng)程序同1.2.3，生成擴(kuò)增曲線及溶解曲線，評(píng)價(jià)其特異性。

1.2.6 多重實(shí)時(shí)PCR的重復(fù)性、穩(wěn)定性 每株菌進(jìn)行10次重復(fù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)及變異系數(shù)(CV)[11]。

1.2.7 糞便模擬樣本檢測(cè)

(1) 菌株的培養(yǎng)：將甘油保存的菌株，劃線于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑取單菌落，接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/mim，過(guò)夜培養(yǎng)。用生理鹽水調(diào)至麥?zhǔn)蠞岫葹?(菌濃度約為3×108CFU/mL)[12]，然后進(jìn)行10倍稀釋，使其終濃度為3×103CFU/mL。

(2) 糞便處理：取3 g健康人糞便于30 mL PBS中，混勻備用。

(3) 糞便模擬標(biāo)本：將1.2.7(1)的菌液與1.2.7(2)的糞便溶液按1∶1(體積比)進(jìn)行混勻，備用。

(4) 樣本檢測(cè)：用DNA提取試劑盒進(jìn)行糞便模擬標(biāo)本DNA提取，用1.2.5中多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行模擬標(biāo)本的檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以(x±SD)形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 加尾引物單重?zé)晒釶CR的建立

由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶單一，與預(yù)期大小一致；熒光曲線圖呈現(xiàn)典型的“S”型曲線，溶解曲線單一峰，無(wú)非特異擴(kuò)增。

2.2 多重實(shí)時(shí)PCR的建立

2.2.1 普通引物 由圖2(a)可知，普通引物具有良好擴(kuò)增效率；圖2(b)中EAEC(aggR)、EHEC(eae)及ETEC(LT)溶解曲線峰不單一、陰性對(duì)照出現(xiàn)假陽(yáng)性；圖2(c)中A、D泳道出現(xiàn)兩條帶，其中一條為目的片段，另一條為100 bp左右的非目的片段；上述結(jié)果均表明普通引物產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增。

2.2.2 加尾引物 由圖3可知，加尾引物具有良好的擴(kuò)增效率，4對(duì)引物溶解曲線具有單一溶解峰，陰性對(duì)照無(wú)非特異性擴(kuò)增和二聚體的產(chǎn)生，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步證實(shí)了加尾引物可有效減少二聚體。

對(duì)比圖2、3可知，在多重?zé)晒舛縋CR體系中，加尾引物的特異性高于普通引物。

2.3 多重實(shí)時(shí)PCR的特異性

由表5可知，1株EPEC、2株EHEC、1株EIEC、1株ETEC、1株EAEC及1株志賀氏菌呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，其余均為陰性。

M. 2 000 bp Marker A. EAEC(aggR) B. EHEC(eae) C. EPEC(eae) D. ETEC(LT) E. EIEC(ipaH) F. 陰性對(duì)照

M. 2 000 bp Marker A. EAEC(aggR) B. EHEC(eae) C. EPEC(eae) D. ETEC(LT) E. EIEC(ipaH) F. 陰性對(duì)照

M. 2 000 bp Marker A. EAEC(aggR) B. EHEC(eae) C. EPEC(eae) D. ETEC(LT) E. EIEC(ipaH) F. 陰性對(duì)照

Duttas等[13]研究表明，eae引物既能擴(kuò)增EHEC也能擴(kuò)增EPEC。志賀氏菌與EIEC具有類似的基因組特征和臨床表現(xiàn)，研究[13]發(fā)現(xiàn)幾乎所有引物未能區(qū)分志賀氏菌與腸侵襲性大腸桿菌。ipaH引物為EIEC與志賀氏菌群所共有引物，試驗(yàn)中針對(duì)EIEC的ipaH引物也能擴(kuò)增志賀氏菌，在實(shí)際檢測(cè)中可能無(wú)法區(qū)分這兩種細(xì)菌。

2.4 多重實(shí)時(shí)PCR的重復(fù)性、穩(wěn)定性

由圖4可知，每種大腸桿菌擴(kuò)增曲線與溶解曲線基本一致，而表6中，5種大腸桿菌Ct<5%，表明其具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.5 糞便模擬樣本檢測(cè)

由圖5可知，EAEC、EHEC、EPEC、ETEC、EIEC檢測(cè)靈敏度分別為105，105，106，104，105CFU/mL，試驗(yàn)建立的多重PCR敏感性為105CFU/mL左右。由于體系中有多條引物存在，可能影響試驗(yàn)的敏感性，而模擬樣本較復(fù)雜，含有糞便中的各種DNA模板。而在腹瀉糞便樣本中往往需進(jìn)一步增菌培養(yǎng)，菌液濃度遠(yuǎn)高于試驗(yàn)方法檢測(cè)的最低限，對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。此外試驗(yàn)方法檢測(cè)的特異性不受復(fù)雜樣本影響，可保證結(jié)果的正確性。

表5 多重實(shí)時(shí)PCR菌株的測(cè)定?

? “—”為陰性結(jié)果；“+”為陽(yáng)性結(jié)果。

A. EAEC(aggR)；B. EHEC(eae)；C. EPEC(eae)；D. ETEC(LT)；E. EIEC(ipaH)；F. 陰性對(duì)照

圖4 5種大腸桿菌多重實(shí)時(shí)PCR重復(fù)性擴(kuò)增曲線

Figure 4 Reproducible amplification curves and dissolution curves of muiplex real-time PCR for five kinds ofEscherichiacoli

圖5 5種大腸桿菌模擬樣本敏感性

菌株CtCV/%菌株CtCV/%EAEC10.558±0.196 0512ETEC10.791±0.198 5672EHEC15.492±0.224 4911EIEC8.406±0.149 9472EPEC16.533±0.424 3363

3 結(jié)論

將HAND系統(tǒng)與多重實(shí)時(shí)PCR結(jié)合，建立了一種在單管內(nèi)能同時(shí)檢測(cè)5種致瀉性大腸桿菌的快速檢測(cè)方法，敏感性為104～106CFU/mL。相比于常規(guī)多重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，該方法明顯降低了非特異性擴(kuò)增，具有更高的特異性。試驗(yàn)克服了核酸檢測(cè)中特異性的問(wèn)題，避免了假陽(yáng)性的產(chǎn)生，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，滿足對(duì)致瀉性大腸桿菌的初步篩選。但試驗(yàn)方法的敏感性較低，后續(xù)可通過(guò)增加檢測(cè)循環(huán)數(shù)和篩選更優(yōu)引物以提高檢測(cè)限。