吳海超 丁 飛 趙 攀

（佳和農牧股份有限公司，湖南長沙 410000）

目前很多規(guī)模豬場都建立了本場的動物疾病診斷實驗室。而抗體檢測方法作為一種評估豬群健康狀況的手段，以靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定、高通量、易于操作等優(yōu)點廣泛應用于臨床豬場生產中。相比傳統(tǒng)的動物疾病診斷方法，抗體檢測有其巨大的優(yōu)勢，但是對于血清樣本的質量要求相對較高，因為血清樣品的質量可直接影響抗體檢測結果的準確性。

為調查不合格血清樣品質量對抗體檢測結果的影響，同時也為了確?？贵w檢測結果的準確性，特設計開展本試驗，旨在為規(guī)范豬場送檢合格的血清樣品提供參考依據。

1 材料

1.1 主要儀器與設備

酶標儀，美國Thermo公司；不同量程移液器，德國Eppendorf公司；離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 檢測試劑盒

豬瘟病毒抗體試劑盒（批號：M101）、豬藍耳病抗體試劑盒（批號：M211）、豬偽狂病野毒抗體試劑盒（批號：EP435）購自于美國IDEXX公司，由長沙達可思生物科技有限公司提供。

1.3 樣品來源

某豬場采集的新鮮血液，樣品包括懷孕母豬、后備母豬、保育豬（46日齡）、育肥豬（142日齡）不同階段豬群血清。

2 方法

2.1 樣品制備

豬場采集不同階段豬群血液各5份，共20份，將采集的每份新鮮血液制備成標準、未分離、輕度溶血和重度溶血4種血清樣品狀態(tài)，具體如下圖（圖1、圖2、圖3、圖4）。

圖1 標準血清

圖2 未分離血清

圖3 輕度溶血

圖4 重度溶血

2.2 樣品分組

根據制備的4種血清狀態(tài)對其進行分組，將標準血清、未分離血清、輕度溶血和重度溶血血清分別分為A、B、C、D 4組。

2.3 抗體檢測

分組之后，嚴格按照豬瘟、藍耳病、偽狂犬病野毒抗體試劑盒操作說明書對4組血清樣品進行檢測，并保證檢測時溫度的穩(wěn)定性和操作條件的統(tǒng)一。

2.4 結果分析

根據各項抗體試劑盒檢測得到的OD值分別計算4組血清樣品的豬瘟抗體阻斷率、藍耳病抗體S/P值和偽狂犬病野毒抗體S/N值，以A組標準血清組檢測結果為參考值，分析B、C、D 3組血清質量不合格組對各項抗體檢測結果的影響。

3 試驗結果

3.1 各項抗體檢測結果

通過同一批號豬瘟抗體檢測試劑盒、藍耳病抗體檢測試劑盒、偽狂犬病野毒抗體檢測試劑盒在同一室溫條件下對A、B、C、D 4組血清進行了2輪抗體檢測，通過對2輪重復試驗檢測結果進行整理，計算A、B、C、D 4組血清的豬瘟抗體平均阻斷率、藍耳病抗體S/P平均值和偽狂犬病野毒抗體S/N平均值。發(fā)現4組血清中豬瘟、藍耳病抗體平均值均以A組標準血清組平均值最低，而偽狂犬病野毒抗體S/N值平均值以A組最高。相比A組，B、C、D 3組質量不合格血清組豬瘟抗體和藍耳病抗體水平普遍上升，而偽狂犬病野毒抗體水平普遍下降，具體結果見表1及圖5。由此得出，血清質量不合格時，容易使檢測結果出現誤差，導致豬瘟、藍耳病及偽狂犬病野毒抗體假陽性結果的出現，與岳展尹[1]報道的結果一致。尤其是對于偽狂犬病野毒抗體的檢測，血清樣品質量是否合格影響較大。

圖5 豬瘟、藍耳病及偽狂犬病野毒抗體平均值變化

3.2 群體檢測結果樣本上升與下降

表1 4組血清樣品豬瘟、藍耳病、偽狂犬病野毒抗體水平平均值變化

以A組抗體檢測結果為參考值，計算B、C、D 3組豬瘟抗體阻斷率、藍耳病抗體S/P值和偽狂犬病野毒抗體S/N值。通過對4組血清樣品抗體檢測結果進行對比分析發(fā)現，相比A組，B、C、D 3組大部分樣品豬瘟抗體、藍耳病抗體的檢測結果存在上升，部分樣品偽狂犬病野毒抗體檢測結果存在下降。其中豬瘟抗體和藍耳病抗體樣品檢測結果上升比例達到了65%以上，偽狂犬病野毒抗體樣本檢測結果下降比例在35%以上，具體結果見表2及圖6。

表2 4組血清樣品豬瘟、藍耳病、偽狂犬病野毒抗體檢測結果變化比例 （%）

4 討論

通過3種常規(guī)疾病抗體試劑盒對標準血清和3組質量不合格血清樣品進行檢測，分析其結果發(fā)現：血清樣本質量不合格會對抗體檢測結果造成影響，導致豬瘟抗體阻斷率、藍耳病抗體S/P值的升高和偽狂犬病野毒抗體S/N值的降低，通過升高或降低樣品的檢測值從而對整個群體的抗體水平造成影響，特別是檢測結果在判定值邊界的樣品，如豬瘟抗體阻斷率在90%和30%～40%的樣品，容易導致豬瘟抗體超陽性率和陽性率的升高，藍耳病抗體S/P值在2.5和0.4左右的樣品，同樣引起藍耳病抗體超陽性率和陽性率的升高。對于偽狂犬病野毒抗體的檢測，判定值在0.6和0.7左右時，容易導致偽狂犬野毒假陽性結果的出現，從而造成對整個結果的誤判。因此保證血清樣品的質量在抗體檢測中顯得尤為重要。

血清樣品的質量常受因紅細胞破裂發(fā)生溶血、室溫或冷藏放置時間過長和樣品反復凍融等因素的影響。血清樣品溶血主要由于紅細胞破裂導致細胞內容物中的水、血紅蛋白（Hb）、無機鹽等物質的釋放，血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有類似辣根過氧化物酶的作用，當血紅蛋白及其他非特異性物質吸附至反應孔孔壁，與包被的抗原非特異性結合，在洗滌液未洗干凈時，催化底物出現顯色反應；還有細胞內釋放的一些其他內容物與包被物結合，導致血清中抗體與包被的抗原反應減少，從而減弱顯色反應[2]。因此樣品發(fā)生不同程度的溶血后均會影響抗體檢測結果的準確性。同時樣品在室溫或者冷藏環(huán)境中放置時間過長和樣品在-20℃反復凍融都會引起血清中抗原抗體的降解，也會對檢測結果造成一定的影響。因此在進行抗體檢測時，保證血清樣品的質量很關鍵。

圖6 4組血清樣品豬瘟、藍耳病、偽狂犬病野毒抗體檢測結果上升比例

由于本次試驗選擇的質量不合格血清樣品是由豬場采集的新鮮血液制備而成，因此樣品選擇隨機性很大，各項抗體檢測在判定值邊界的樣品較少，且檢測偽狂犬野毒抗體的血清樣品也全部呈偽狂犬野毒陰性，因此在樣品選擇上存在一定的瑕疵。但是通過本文得出的結論還是可以明顯看出血清質量不合格對抗體檢測的影響，希望通過本研究得出的相關結果能為豬場規(guī)范送樣流程提供借鑒。