程娟　潘天穎　吳郝娟　謝江　許文明

摘要：收集體外受精（in vitro fertilization，IVF）與自然受孕分娩兒童臍血和外周血，提取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平，并進(jìn)行自閉癥兒童行為量表（autism behavior checklist，ABC）評分，彩色多普勒超聲對妊娠11周及21周的胎盤厚度進(jìn)行測量，了解體外受精及自然受孕兒童神經(jīng)行為發(fā)育的差異。結(jié)果顯示，體外受精分娩兒童血清BDNF水平低于自然受孕兒童（P<0.01），ABC量表評分高于自然受孕兒童（P<0.05），孕21周胎盤厚度增厚（P<0.05）。這提示體外受精可能會影響胎盤發(fā)育，并導(dǎo)致兒童神經(jīng)行為的改變。

關(guān)鍵詞：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;體外受精;胎盤厚度;ABC量表

中圖分類號：R729

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674–5124（2019）03–0065–04

A study of neurobehavioral development in children conceived by in vitro fertilization

CHENG Juan1，2， PAN Tianying3， WU Haojuan2， XIE Jiang1，2， XU Wenming3

（1. Clinical Medical College， Southwest Medical University， Luzhou 646000， China;2. The Third Peoples Hospital of Chengdu， Chengdu 610031， China;3. The Second Affiliated West China Hospital of Sichuan University， Chengdu 610041， China）

Abstract： The umbilical cord and peripheral blood of naturally conceived and in vitro fertilization （IVF） children were collected， then serum was extracted. All children were detected the serum brain-derived neurotrophic factor （BDNF） levels with the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.The neurobehaviour scores were evaluated with the autism behavior checklist （ABC）. Color Doppler Ultrasonography was used to measure the placenta thickness at 11 and 21 weeks of pregnancy. To understand the difference of neurobehavioral development between in vitro fertilization and natural conception. The results showed that serum BDNF level of in vitro fertilization children was lower than that of natural conception children （P<0.01）， ABC scale score was higher than that of natural conception children （P<0.05）， and placental thickness increased at 21 weeks of gestation （P<0.05）. This suggests that in vitro fertilization may affect placental development and lead to changes in neural behavior in children.

Keywords： brain-derived neurotrophic factor; in vitro fertilization; placental thickness; autism behavior checklist

0 引言

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高及醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，不孕患者接受體外受精（in vitro fertilization，IVF）技術(shù)的夫婦逐年增多，一般認(rèn)為IVF技術(shù)是相對安全可靠的。然而，目前的動物研究已將某些不良的神經(jīng)發(fā)育結(jié)局與體外受精聯(lián)系起來，盡管針對人類的研究還沒有定論。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在腦內(nèi)合成并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)均廣泛存在和表達(dá)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育以及突觸可塑性、新突觸形成等起重要作用[1-2]。BDNF分泌異常與各種神經(jīng)和精神異常狀況相關(guān)，已報道的有自閉癥、抑郁癥、精神分裂癥、阿爾茨海默氏癥等[3-4]。許多腦發(fā)育異常相關(guān)疾病導(dǎo)致患者的腦和血清BDNF蛋白水平降低[5-6]。大量研究表明BDNF的水平變化可作為兒童神經(jīng)發(fā)育相關(guān)疾病可靠的預(yù)測因子，如已有研究發(fā)現(xiàn)體外受精婦女早期循環(huán)BDNF水平降低與妊娠不良結(jié)局有關(guān)[7]，而具體原因不明確，推測體外受精子代兒童期BDNF水平會發(fā)生變化及其對神經(jīng)行為發(fā)育產(chǎn)生一定的影響。

雖然體外受精后活產(chǎn)兒每年超過出生總數(shù)的1%，但對胎兒-胎盤-神經(jīng)發(fā)育的影響尚不清楚。研究顯示受孕方式對妊娠早期胎盤大小、質(zhì)量無明顯影響[8]，但體外受精的嬰兒存在胎盤增生、出生體重較輕、胎盤早剝的風(fēng)險[9]。體外受精導(dǎo)致胎盤DNA甲基化和參與神經(jīng)元發(fā)育的基因表達(dá)改變，可能對健康和疾病產(chǎn)生長期影響，包括神經(jīng)發(fā)育不良。本研究重點(diǎn)關(guān)注體外受精是否會導(dǎo)致胎盤厚度的改變，從而影響胎兒的大腦發(fā)育，并導(dǎo)致兒童神經(jīng)行為的改變。

因此，本研究擬通過對體外受精兒童血清中BDNF水平及胎盤厚度進(jìn)行定量分析，觀察ABC量表得分情況，評估體外受精對胎盤發(fā)育及血清中BDNF水平與神經(jīng)行為發(fā)育改變的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2008年1月至2011年12月在成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，生殖中心通過IVF技術(shù)成功受孕，并在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院產(chǎn)科分娩長大后3～8歲12例兒童作為IVF組，其中男8例，女4例;另隨機(jī)抽取同期自然受孕在該院產(chǎn)科分娩兒童10例作為對照組，其中男5例，女5例。兩組兒童在年齡（P=0.95）、性別（P=0.67）等一般資料比較差異均無顯著性（P>0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)儀器與材料

人血清BDNF蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（R&D Systems，USA），試劑盒內(nèi)包括：預(yù)包被96孔板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、帶標(biāo)記的檢測抗體、洗滌緩沖液、顯色劑A和B、終止液及封板膜。酶標(biāo)儀（iMark Microplate Reader 12337，BIO-RAD，USA）;西門子公司Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀;美國GE公司730型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率3.5MHz。自閉癥兒童行為量表（Autism Behavior Checklist，ABC量表），包括57個描述自閉癥兒童的感覺、行為、情緒、語言等方面異常表現(xiàn)的項(xiàng)目。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

用離心管收集胎兒分娩后臍血及受試兒童空腹靜脈血液（晨血）4mL，室溫（22～25°C）放置30～60min凝集，3000r/min離心10min，收集上清并保存于–20°C待測。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）按照人血清BDNF蛋白測定試劑盒說明書進(jìn)行檢測。方法簡述如下：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔和空白孔，取10μL血清進(jìn)行檢測，37°C溫育60min，手工洗板5次，依次加入顯色劑A/B后恒溫箱37°C避光孵育15min。每孔加入終止液后5min內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm波長處測定各孔的光密度（optical density，OD）值。預(yù)實(shí)驗(yàn)板間，板內(nèi)變異系數(shù)均<10%。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R≥0.9900。正式實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)抽取8個樣本，每個樣本重復(fù)測試2次，兩次測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，該部分結(jié)果不作為實(shí)驗(yàn)最終的分析結(jié)果。對所有的兒童采用自閉癥兒童行為量表（autism behavior checklist，ABC）進(jìn)行行為癥狀的評定。量表共包含57個問題，分別描述了兒童的感覺（S）、社會交往（R）、軀體運(yùn)動（B）、語言（L）、生活自理能力（S）5大功能區(qū)，每個問題按1～4級評分，各項(xiàng)得分相加得總分，分?jǐn)?shù)越高則表明自閉癥行為越嚴(yán)重。

彩色多普勒超聲測量孕11周及21周胎盤厚度，測量部位取胎盤中央最厚部從子面絨毛板至母體面的基底層。同一胎兒均重復(fù)測量2～3次以減少其測量誤差。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)資料采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

兩組兒童血清BDNF水平測定結(jié)果見圖1，從該圖可以看出IVF組兒童血清BDNF水平（1038.74±714.45）pg/mL低于對照組兒童（2000.16±578.73）pg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=–3.418，P=0.003）;兩組兒童臍血BDNF水平IVF組低于對照組（見圖2），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=–4.99，P=0.623）。兩組兒童ABC量表評分結(jié)果見圖3，該圖顯示IVF組兒童評分22.58±22.35高于對照組兒童7.00±9.46，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.191，P=0.044）。將血清BDNF水平和ABC量表評分進(jìn)行Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，兩者不存在相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。

進(jìn)一步對IVF孕婦在孕期的B超檢查和其他生化指標(biāo)進(jìn)行分析，B超結(jié)果顯示孕11周胎盤厚度（見圖4）兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.13，P=0.99）;而孕21周胎盤厚度IVF組（3.48±0.45）cm較對照組（3.09±0.41）cm增厚（見圖5），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.223，P=0.036）。將胎盤厚度和血清BDNF水平及ABC量表評分進(jìn)行Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，不存在相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。

3 討論

本研究以IVF和自然受孕兒童為研究對象，從血清BDNF水平、ABC量表評分和胎盤厚度方面探討了它們之間的差異。結(jié)果表明，體外受精兒童胎盤增厚，血清中BDNF水平降低，出現(xiàn)與自閉癥神經(jīng)行為發(fā)育相關(guān)的量表評分升高的趨勢。提示對于IVF兒童需要重點(diǎn)關(guān)注與自閉癥相關(guān)的神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)。

已有研究對體外受精出生兒童血清BDNF水平及認(rèn)知和行為發(fā)育的認(rèn)知并不一致。Ramer等[10]研究發(fā)現(xiàn)，體外受精周期開始前血清中BDNF水平的升高與子宮外植入有關(guān)，而宮內(nèi)植入的婦女體內(nèi)BDNF水平的小幅升高與隨后的懷孕失敗有關(guān)。體外受精早期血液循環(huán)中BDNF水平降低與妊娠不良結(jié)局有關(guān)[9]。Yeung等[11]報道體外受精與出生后第1年的不良認(rèn)知和行為發(fā)育無關(guān);但隨著時間的推移，體外受精子代在年老時仍可能發(fā)展為神經(jīng)發(fā)育缺陷[12]。Mainigi等[13]的研究結(jié)果也顯示，體外受精的子代大腦皮層神經(jīng)元密度下降，出現(xiàn)焦慮樣行為。本課題組通過對體外受精出生3～8歲兒童血清檢測發(fā)現(xiàn)BDNF水平降低而剛分娩時臍血BDNF水平無明顯差異，同時ABC量表評分較高，體外受精兒童表現(xiàn)出異常行為，但究竟是BDNF水平對兒童神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生影響還是體外受精本身會對神經(jīng)行為發(fā)育造成影響有待進(jìn)一步的研究。因此，仍需要繼續(xù)對不同年齡階段的兒童進(jìn)行長期隨訪研究，找到針對性的治療方法。

與自然受孕相比，體外受精后胎盤增生的發(fā)生率增加，本課題組通過對體外受精孕11周及21周胎盤厚度檢測發(fā)現(xiàn)孕21周胎盤厚度增加，BDNF在妊娠期胎盤血管成熟過程中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)胎盤和胎兒發(fā)育[14];目前尚無BDNF變化與胎盤厚度相關(guān)方面的確切研究，BDNF水平變化是否通過調(diào)節(jié)胎盤發(fā)育來影響后代神經(jīng)行為發(fā)育有待進(jìn)一步的探索。Yi等[15]研究發(fā)現(xiàn)BDNF基因在牛卵母細(xì)胞和體外受精胚胎不同階段的mRNA水平不同，研究結(jié)果為神經(jīng)營養(yǎng)素在促進(jìn)早期胚胎發(fā)育以及通過共培養(yǎng)系統(tǒng)促進(jìn)顆粒細(xì)胞生長方面的作用提供了證據(jù)，說明BDNF可以直接或間接促進(jìn)牛早期胚胎發(fā)育，而目前人類體外受精后BDNF水平對胚胎及后代神經(jīng)行為發(fā)育的影響尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)束語

本研究發(fā)現(xiàn)體外受精兒童胎盤增厚，血清中BDNF水平降低，子代出現(xiàn)與自閉癥神經(jīng)行為發(fā)育相關(guān)的量表評分升高的趨勢。推測可能為體外受精通過BDNF水平影響胎盤-胎兒發(fā)育，腦功能受損，從而導(dǎo)致兒童神經(jīng)行為的改變，可能會增加體外受精兒童患神經(jīng)發(fā)育相關(guān)疾病如自閉癥與抑郁等心理疾病的風(fēng)險，這提示需要對體外受精后不同時期兒童長期神經(jīng)發(fā)育監(jiān)測相關(guān)的研究，對臨床疾病的預(yù)測或預(yù)防具有參考價值。同時BDNF可作為一種潛在的預(yù)測神經(jīng)發(fā)育類疾病風(fēng)險的生物標(biāo)志物，目前BDNF已被證實(shí)是一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，未來有望作為某些神經(jīng)發(fā)育類疾病的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] EDELMANN E， LESSMANN V， BRIGADSKI T. Pre-and postsynaptic twists in BDNF secretion and action in synaptic plasticity[J]. Neuropharmacology， 2014， 76： 610-627.

[2] PANJA D， BRAMHAM C R. BDNF mechanisms in late LTP formation： A synthesis and breakdown[J]. Neuropharmacology， 2014， 76： 664-676.

[3] MAUSSION G， MOALIC J M， SIMONNEAU M， et al. Increased expression of BDNF mRNA in the frontal cortex of autistic patients[J]. Behav Brain Res， 2018， 359（1）： 903-909.

[4] MCCARTHY D M， BROWN A N， BHIDE P G. Regulation of bdnF expression by cocaine[J]. Yale J Biol Med， 2012， 85（4）： 437-446.

[5] JIANG H， CHEN S， LI C， et al. The serum protein levels of the tPA-BDNF pathway are implicated in depression and antidepressant treatment[J]. Transl Psychiatry， 2017， 7（4）： e1079.

[6] BORBA E M， DUARTE J A， BRISTOT G， et al. Brain-derived neurotrophic factor serum levels and hippocampal volume in mild cognitive impairment and dementia due to alzheimer disease[J]. Dement Geriatr Cogn Dis Extra， 2016， 6（3）： 559- 567.

[7] RAMER I， KRUCZEK A， DOULAVERIS G， et al. Reduced circulating concentration of brain-derived neurotrophic factor is associated with peri-and Post-implantation failure following In vitro fertilization-embryo transfer[J]. Am J Reprod Immunol， 2016， 75（1）： 36-41.

[8] CHURCHILL S J， WANG E T， AKHLAGHPOUR M， et al. Mode of conception does not appear to affect placental volume in the first trimester[J]. Fertil Steril， 2017， 107（6）： 1341-1347.

[9] SUNDHEIMER L W， CHAN J L， BUTTLE R， et al. Mode of conception does not affect fetal or placental growth parameters or ratios in early gestation or at delivery[J]. J Assist Reprod Genet， 2018， 35（6）： 1039-1046.

[10] RAMER I， KANNINEN T T， SISTI G， et al. The serum brain- derived neurotrophic factor concentration prior to initiation of an in vitro fertilization cycle predicts outcome[J]. J Reprod Immunol， 2016， 116： 46-49.

[11] YEUNG E H， SUNDARAM R， BELL E M， et al. Examining infertility treatment and early childhood development in the upstate KIDS study[J]. JAMA Pediatr， 2016， 170（3）： 251- 258.

[12] BRENDGEN M， GIRARD A， VITARO F， et al. Gene- environment correlation linking aggression and peer victimization： do classroom behavioral norms matter？[J]. J Abnorm Child Psychol， 2015， 43（1）： 19-31.

[13] MAINIGI M， ROSENZWEIG J M， LEI J， et al. Peri- implantation hormonal milieu： elucidating mechanisms of adverse neurodevelopmental outcomes[J]. Reprod Sci， 2016， 23（6）： 785-794.

[14] SAHAY A S， SUNDRANI D P， JOSHI S R. Neurotrophins： role in placental growth and development[J]. Vitam Horm， 2017， 104： 243-261.

[15] YI K L， ZHOU X， SHI D S， et al. The mRNA expression of brain-derived neurotrophic factor in oocytes and embryos and its effects on the development of early embryos in cattle[J]. Animal， 2008， 2（12）： 1786-1794.

（編輯：莫婕）