鞏子漢 虎峻瑞 段永強 成映霞 王強 付曉艷 楊曉軼 馬駿 白敏

摘要：目的? 觀察白及多糖對胃潰瘍模型大鼠血清白細胞介素（IL）-2R、IL-4含量及胃組織Caspase-8表達的影響，探討其治療胃潰瘍的作用機制。方法? 60只Wistar大鼠隨機分為空白組和造模組，造模大鼠采用乙酸直接燒灼法制作胃潰瘍模型，將成模大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、陽性對照組和白及多糖高、中、低劑量組，每組10只?？瞻捉M和模型組大鼠給予10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，白及多糖高、中、低劑量組大鼠分別給予白及多糖0.5、0.25、0.125 g/（kg·d）藥液灌胃，陽性對照組大鼠給予雷尼替丁0.3 g/（kg·d）藥液灌胃，連續(xù)15 d。ELISA檢測大鼠血清IL-2R、IL-4含量，實時熒光定量PCR檢測大鼠胃組織IL-2R、IL-4及Caspase-8基因表達，Western blot檢測Caspase-8蛋白表達。結(jié)果? 與空白組比較，胃潰瘍大鼠一般生存狀況較差，IL-2R含量及基因表達明顯升高、IL-4含量及基因表達明顯降低（P<0.05，P<0.01），胃組織Caspase-8基因和蛋白表達顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，白及多糖高、中、低劑量組大鼠IL-2R含量及基因表達均降低、IL-4含量及基因表達均升高，Caspase-8基因和蛋白表達均降低，白及多糖高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論? 白及多糖通過下調(diào)模型大鼠血清IL-2R、上調(diào)IL-4含量及下調(diào)胃組織Caspase-8表達保護胃黏膜，達到治療胃潰瘍的作用。

關(guān)鍵詞：白及多糖;胃潰瘍;Caspase-8;白細胞介素-2受體;白細胞介素-4;大鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0035-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.009????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Bletilla baicalensis polysaccharides on serum IL-2R， IL-4 level and Caspase-8 expression in model rats with gastric ulcer. Methods Totally sixty Wistar rats were randomly divided into blank group and modeling group. The gastric ulcer model was reproduced by acetic acid direct cauterization. The model rats were divided into model group， positive control group and Bletilla baicalensis polysaccharide high-， medium-， and low-dosage groups according to random number table method， with 10 rats in each group. Rats in blank group and model group were given 10 mL/（kg·d） distilled water for gavage; rats in Bletilla baicalensis polysaccharide high-， medium-， and low-dosage groups were given 0.5， 0.25， 0.125 g/kg Bletilla baicalensis polysaccharide for gavage; rats in positive control group were given 0.3 g /（kg·d） ranitidine for gavage. All groups received medicine for successive 15 d. After 15 days of treatment， serum IL-2R and IL-4 levels were detected by ELISA， and real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the gene expressions of IL-2R， IL-4 and Caspase-8 in stomach tissues. The protein expression of Caspase-8 was detected by Western blot. Results Compared with the blank group， gastric ulcer rats had worse general survival， higher IL-2R content and gene expression level， lower IL-4 content and gene expression level （P<0.05， P<0.01）， and higher levels of Caspase-8 gene and protein expression in stomach tissue （P<0.05）. Compared with the model group， the levels of IL-2R and gene expression in Bletilla baicalensis polysaccharide high-， medium-， and low-dosage groups decreased; the levels of IL-4 and gene expression increased; the levels of Caspase-8 gene and protein expression decreased， with statistical significance in Bletilla baicalensis polysaccharide high-dosage group （P<0.05）. Conclusion Bletilla baicalensis polysaccharide can protect gastric mucosa to treat gastric ulcer by down-regulating serum IL-2R， up-regulating IL-4 content and down-regulating Caspase-8 expression in model rats.

Keywords： Bletilla baicalensis polysaccharide; gastric ulcer; Caspase-8; IL-2R; IL-4; rats

胃潰瘍作為一種常見、多發(fā)的消化性潰瘍疾病，臨床遷延難愈、易反復發(fā)作。研究表明，物理刺激及化學反應等引起的胃黏膜發(fā)生氧化應激損傷、促炎因子的大量釋放，均是胃潰瘍發(fā)病的主要因素[1-3]。白及味苦性微寒，有止血消腫、生肌斂瘡功效，常與黃連、貝母、輕粉等配伍治療瘡癰已潰、久不收口者。白及主要化學成分為白及多糖已得到廣泛認可[4]，其可促進大鼠胃潰瘍創(chuàng)面的愈合，其機制可能與白及多糖提高創(chuàng)面羥脯氨酸成分，促進創(chuàng)面組織中纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞增生，提高創(chuàng)傷巨噬細胞數(shù)量有關(guān)[5]。本實驗通過研究白及多糖對大鼠一般生存狀況及其血清白細胞介素（IL）-2R、IL-4含量，以及胃組織Caspase-8基因和蛋白表達的影響，探討白及多糖治療胃潰瘍的作用機制。

1? 材料與方法

1.1? 動物

SPF級健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量（180±10）g，甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗中心，動物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗室，溫度22～25 ℃，相對濕度45%～55%，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

白及多糖，純度99%，西安澤郎生物科技有限公司，批號XAZL171026-1;鹽酸雷尼替丁片，湖南漢森制藥股份有限公司，批號1808202。

1.3? 試劑

冰乙酸，天津市富宇精細化工有限公司，批號20170327;乙醇，天津市富宇精細化工有限公司，批號20180222;IL-2R、IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒，上海將來實業(yè)股份有限公司，批號201901;Trizol，Ambion公司，批號152104;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司，批號AI40704A;RT-qPCR試劑盒，TaKaRa公司，批號AI61180A;GAPDH抗體，ImmunoWay公司，批號B1501;Caspase-8 Anti-body，GeneTex公司，批號40044;辣根酶標記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物科技有限公司，批號112971;Nuclease-Free Water，Promega公司，批號0000277459;30%制膠液，北京索萊寶科技有限公司，批號20180927;PMSF，北京索萊寶科技有限公司，批號20171113;PageRuler Prestained Protein Ladder，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號00442922;Albumin Bovine V，北京索萊寶科技有限公司，批號829Q052;SDS，北京索萊寶科技有限公司，批號1029H033;Glycine，北京索萊寶科技有限公司，批號903L062;Tris，北京索萊寶科技有限公司，批號929Y071;Tris 6.8，北京索萊寶科技有限公司，批號20180322;Tris 8.8，北京索萊寶科技有限公司，批號20180928。

1.4? 儀器

CT14RD型高速低溫離心機，上海天美生化儀器設備工程公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱，江蘇金壇友聯(lián)儀器研究所;Benchmark Plus酶聯(lián)免疫檢測儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測定儀、S1000TM反逆轉(zhuǎn)錄儀、Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)、CFX96TM Optics Module PCR儀，美國BIO-RAD公司;SCIENTZ-48型高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.5? 造模

參照文獻[6]方法：大鼠術(shù)前禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液（20 mg/kg）腹腔注射麻醉，常規(guī)固定，備毛，消毒，自劍突下沿腹中線切開腹壁約2 cm打開腹腔，自肝臟后找出胃，暴露胃前壁竇體部，將自制直徑5 mm、長40 mm圓柱狀裝置置于胃前壁胃竇部漿膜層處，吸取20 μL冰乙酸注入圓柱狀裝置，直接燒灼60 s，再用生理鹽水清洗創(chuàng)口，操作完畢后覆蓋網(wǎng)膜，間斷縫合腹膜、腹壁各層組織、皮膚。

1.6? 分組及給藥

將60只Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)3 d，按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、陽性對照組和白及多糖高、中、低劑量組，每組10只。除空白組大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余大鼠造模后第2日開始給藥。陽性對照組給予鹽酸雷尼替?。?00 mg/kg）藥液灌胃，白及多糖高、中、低劑量組分別給予白及多糖（0.5、0.25、0.125 g/kg）藥液灌胃[7-9]，空白組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。給藥體積2 mL，每日1次，連續(xù)15 d。

1.7? 標本采集及處理

大鼠于末次灌胃給藥后禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液（20 mg/kg）腹腔注射麻醉，股動脈采血，4 ℃、3500 r/min離心10 min制備血清，置于-80 ℃冰箱保存，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測血清IL-2R、IL-4含量。稱取胃組織，凍存于-80 ℃冰箱以備實時熒光定量PCR及Western blot檢測。

1.8 ?ELISA檢測大鼠血清白細胞介素-2受體、白細胞介素-4含量

按照試劑盒說明書檢測大鼠血清IL-2R、IL-4含量。將試劑盒和待測血清平衡至室溫，稀釋準備對照品和洗滌液，按要求加樣、溫育、洗滌、溫育、洗滌、顯色、終止。酶標儀測定450 nm波長處各孔吸光度，并繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.9? 實時熒光定量PCR檢測胃組織白細胞介素-2受體、白細胞介素-4及Caspase-8基因表達

采用Trizol法提取總RNA，測定其OD260/OD280均在1.8～2.0之間，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增IL-2R、IL-4、Caspase-8基因片段。實驗所用引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。β-actin F：5'-TGACA GGATGCAGAAGGAGATTAC-3'，R：5'-GAGCCAC CAATCCACACAGA-3'，產(chǎn)物長度102 bp;IL-4 F：5'-TGCACCGAGATGTTTGTACCAGA-3'，R：5'-TTG CGAAGCACCCTGGAAG-3'，產(chǎn)物長度92 bp;IL-2R F：5'-TACAAGAACGGCACCATCCTA-3'，R：5'-TTTCT CGATTTGTCATGGGAC-3'，產(chǎn)物長度94 bp。以β-actin作為內(nèi)參基因，反應體系及參數(shù)依據(jù)GoTaq 3-Step RT-qPCR試劑盒說明書設置，相同模板相同基因設3復孔、6次平行實驗，得各擴增反應的Ct值。采用樣點擬合法分析結(jié)果得到目的基因和β-actin的Ct值，以β-actin為內(nèi)參，用比較Ct值法計算相對表達量。ΔΔCt=（測試組目的基因Ct值-測試組內(nèi)參基因Ct值）÷（空白組目的基因Ct值-空白組內(nèi)參基因Ct值），相對表達量為2-ΔΔCt。

1.10? Western blot檢測胃組織Caspase-8蛋白表達

提取胃組織蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。GAPDH Antibody溶液配制（1∶1000）：GAPDH Anti-body 10 μL，封閉液10 mL;Caspase-8 Antibody配制（1∶2000）：JNK Antibody 5 μL，封閉液10 mL。37 ℃搖床4 h，1×TBST洗滌3次×10 min，加入HRP標記羊抗兔二抗。二抗溶液配制：辣根酶標記山羊抗兔（1∶5000）山羊抗兔二抗2 μL，牛奶封閉液10 mL。室溫孵育1 h，1×TBST洗滌3次×10 min，采用化學發(fā)光底物進行化學發(fā)光，顯影后用Bio-RAD Quantity One圖像分析軟件進行掃描分析。

1.11? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間均數(shù)差異比較用方差分析，方差齊用LSD法比較，方差不齊用Tamhanes'T2法比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1? 一般狀況

空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應靈敏，皮毛濃密光澤，活動及攝食量正常，體質(zhì)量正常增長。胃潰瘍大鼠第2日開始表現(xiàn)為瞇眼、倦臥嗜睡、被毛稀疏失澤、攝食量減少、反應遲鈍、每日攝食量和體質(zhì)量增加減緩等。各給藥組大鼠在治療第7日開始被毛稀疏失澤、反應遲鈍、少食怠動、消瘦倦臥、逐漸減輕，第15日各給藥組大鼠上述表現(xiàn)明顯改善，趨于正常，尤以白及多糖高劑量組改善明顯。

2.2? 白及多糖對模型大鼠白細胞介素-2受體 mRNA表達和含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠IL-2R mRNA表達和含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，白及多糖高劑量組和陽性對照組大鼠IL-2R mRNA表達和含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

2.3? 白及多糖對模型大鼠白細胞介素-4 mRNA表達和含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠IL-4 mRNA表達和含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，白及多糖高劑量組和陽性對照組大鼠IL-4 mRNA表達和含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

2.4? 白及多糖對模型大鼠胃組織Caspase-8基因和蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃組織Caspase-8基因和蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠胃組織Caspase-8基因和蛋白表達均有下降趨勢，其中陽性對照組和白及多糖高劑量組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表3、圖1。

3? 討論

胃潰瘍以周期性、節(jié)律性的上腹部疼痛為主要表現(xiàn)，一般認為幽門螺桿菌感染、非甾體類抗炎藥的使用、缺血、應激、壓力、酒精攝入、吸煙和營養(yǎng)不足等因素均可誘發(fā)[10-11]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》載：“白及味苦，主癰腫，敗疽，胃中邪氣，惡瘡不收?！爆F(xiàn)代研究表明，白及具有止血消腫、生肌斂瘡之功，對消化性潰瘍療效顯著[12-13]。研究表明，白及多糖有降低應激大鼠胃黏膜損傷的作用[14-15]。

胃潰瘍的發(fā)生與機體組織內(nèi)炎癥因子分泌水平紊亂密切相關(guān)，活化的CD4+T細胞、CD8+T細胞可產(chǎn)生IL-2，IL-2可促進活化B細胞增殖，其靶細胞包括T細胞、NK細胞、B細胞等[16-17]，這些細胞表面均可表達IL-2R[18]，而可溶性IL-2R是一種免疫抑制因子，在炎癥反應中具有重要作用[19]。IL-4主要來源于活化的T細胞，具有抑制炎癥與免疫抑制的功能，在胃腸黏膜微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[20]。研究表明，Caspase家族在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，具有Caspase級聯(lián)反應，可促進細胞凋亡，尤其是Caspase-8與凋亡的關(guān)系最為密切，在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用[21-22]。

本實驗結(jié)果顯示，白及多糖可下調(diào)模型大鼠胃組織Caspase-8基因及蛋白表達，進而調(diào)節(jié)大鼠血清IL-2R、IL-4含量，改善胃黏膜組織微環(huán)境免疫功能，降低模型大鼠血清IL-2R含量，升高模型大鼠血清IL-4含量，通過調(diào)節(jié)Caspase-8、IL-2R及IL-4等細胞因子分泌之間的平衡態(tài)，提高胃組織急慢性炎癥的防御功能，調(diào)節(jié)機體的免疫機能，改善胃潰瘍大鼠的一般生存狀態(tài)，促進受損結(jié)腸組織黏膜修復。與模型組比較，白及多糖高劑量組大鼠一般生存狀況顯著改善，血清IL-2R含量和基因表達顯著降低，IL-4含量和基因表達水平顯著升高，胃組織Caspase-8基因和蛋白表達顯著降低，提示高劑量白及多糖可顯著下調(diào)Caspase-8基因和蛋白的表達，維持IL-2R和IL-4等細胞因子間的平衡，減輕由此產(chǎn)生的炎性級聯(lián)放大反應，提高胃組織對炎癥因子的防御機能，促進黏膜組織細胞的修復，進而發(fā)揮保護胃黏膜作用。

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（收稿日期：2019-04-22）

（修回日期：2019-05-14;編輯：華強）