張晨夕，杜顯生，陳丹丹

（牡丹江恒豐紙業(yè)有限公司，黑龍江 牡丹江 157013）

異噻唑啉酮是一種高效殺菌劑，廣泛應(yīng)用于造紙生產(chǎn)中抑制漿料的腐敗、變質(zhì)。由于很多種類的紙張對微生物污染都有限量要求，因此異噻唑啉酮的添加成為生產(chǎn)過程控制和保證產(chǎn)品微生物指標(biāo)合格的一種有效途徑。但是人體直接接觸異噻唑啉酮有可能引起皮炎、過敏等反應(yīng)，國家對其在食品容器和食品包裝材料等中的添加也有限量要求[1]，因此有效利用異噻唑啉酮的同時保證它的使用安全性，是特殊用途紙張企業(yè)必須要考慮的問題。

對有限量要求的有效成分進(jìn)行檢測，需要基于實驗室現(xiàn)有檢測能力和水平進(jìn)行試驗設(shè)計。隨著統(tǒng)計技術(shù)的發(fā)展，研究者在方法開發(fā)或試驗設(shè)計過程中，從開發(fā)成本和方法準(zhǔn)確度等方面考慮，都會以試驗次數(shù)少、參數(shù)優(yōu)化準(zhǔn)為原則來尋求最優(yōu)設(shè)計。但在實際操作中，因?qū)憫?yīng)變量有影響的可控因子和不可控因子較多，而且因子之間可能存在交互作用，因此試驗?zāi)Ｐ偷慕⒕托枰写罅康臄?shù)據(jù)和繁復(fù)的運(yùn)算支撐。近些年被大家熟知并廣泛應(yīng)用的一些實驗設(shè)計軟件解決了這些問題。

本研究基于試驗設(shè)計（design of experiments，DOE）及響應(yīng)曲面分析（response surface method，RSM）等，可有效區(qū)分關(guān)鍵因子和噪聲因子，并分析是否存在因子間交互作用及找出最佳因子水平[2]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號Clarus 680，質(zhì)量范圍為1.0～1 200 amu，鉑金埃爾默儀器有限公司）；電子天平（型號MS204S，精度為0.1 mg，梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司）；數(shù)控超聲波發(fā)生器（型號KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

1，2-苯并異噻唑基 -3（2H）-酮（0.1 g/瓶，純度：99.5%，德國DRehrenstorferGmbH，cas號為2634-33-5）；二氯甲烷（4 L/瓶，純度為99.8%，上海安譜試驗科技有限公司）。

2 優(yōu)化試驗設(shè)計

使用質(zhì)量功能展開表對設(shè)計參數(shù)進(jìn)行篩選，在1，2-苯并異噻唑基-3（2H）-酮萃取過程中，篩選出4個主要參數(shù)，包括萃取溶劑選擇、萃取時間、萃取溶劑量和萃取功率，評價萃取效率高低的響應(yīng)變量為加標(biāo)回收率[3]。

2.1 萃取溶劑選擇

用天平稱取0.2 g空白紙樣，采用定量加標(biāo)的形式進(jìn)行加標(biāo)回收率分析。在50 mL具塞錐形瓶中添加20 mL萃取溶劑和80 μL內(nèi)標(biāo)溶液，置于超聲發(fā)生器中，超聲功率選擇300 W超聲20 min，取上清液進(jìn)行離心，離心后上機(jī)分析。在同樣條件下考查丙酮、正己烷、二氯甲烷分別作為萃取溶劑對1，2-苯并異噻唑基-3（2H）-酮檢測結(jié)果的影響，不同萃取溶劑的加標(biāo)回收率及均值如表1所示。

表1 不同萃取溶劑的加標(biāo)回收率%

對不同萃取溶劑的加標(biāo)回收率繪制單值-移動極差控制圖，如圖1～3所示。對各組數(shù)據(jù)的殘差進(jìn)行分析（圖4），保證方法建立的模型的誤差是獨(dú)立的，即殘差是隨機(jī)的、有代表性的、等分散的。各組數(shù)應(yīng)符合正態(tài)分布（圖5），方差相等（圖6），方可進(jìn)行單因子方差分析來判斷不同萃取溶劑的加標(biāo)回收率是否存在差異。

圖1 丙酮溶劑的加標(biāo)回收率單值移動極差控制圖

圖2 二氯甲烷溶劑的加標(biāo)回收率單值移動極差控制圖

可以看到，各組數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性較好，并無超出上、下控制線（±3σ）的情況，說明數(shù)據(jù)均來自穩(wěn)定受控的過程。如圖5所示，3種萃取溶劑的樣本量N均為10，使用Anderson-darling（AD）來檢驗數(shù)據(jù)擬合程度，數(shù)值均較小，擬合較好。正態(tài)檢驗的P值均大于0.05，各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)，且殘差隨機(jī)、正態(tài)（圖4）。對各組數(shù)組進(jìn)行等方差檢驗，方差相等的概率P值＞0.05，方差相等（圖 6）。

圖3 正己烷溶劑的加標(biāo)回收率單值移動極差控制圖

圖4 不同溶劑加標(biāo)回收率殘差圖

圖5 不同溶劑的加標(biāo)回收率概率圖

對使用不同溶劑的加標(biāo)回收率進(jìn)行假設(shè)檢驗，以驗證各組數(shù)據(jù)的均值是否存在顯著性差異。我們設(shè)定原假設(shè)為各溶劑間的加標(biāo)回收率無顯著性差異，備擇假設(shè)為3種溶劑中至少有1種加標(biāo)回收率與其他2種存在顯著性差異。單因子方差分析結(jié)果見表2。

圖6 不同溶劑加標(biāo)回收率等方差檢驗

表2 加標(biāo)回收率的單因子方差分析表

如表2所示，方法建立的數(shù)學(xué)模型的決定系數(shù)R-SQ為86.31%，即總波動中由因子引起的波動占86.31%，模型較好。不同萃取溶劑的數(shù)據(jù)組間方差與同一溶劑數(shù)據(jù)的組內(nèi)方差比為F，F(xiàn)=85.10，組間方差較大，不同溶劑的加標(biāo)回收率差異較大。在95%置信水平下，原假設(shè)成立的概率接近或為零（p值為0.000＜0.05），因此我們推翻原假設(shè)，接受備擇假設(shè)，3種溶劑中至少有1種加標(biāo)回收率與其他2種存在顯著性差異。

單因子方差分析驗證3種溶劑的加標(biāo)回收率存在顯著性差異，計算每種溶劑的加標(biāo)回收率平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，如表3所示。選擇加標(biāo)回收率高、標(biāo)準(zhǔn)差相對較小的二氯甲烷作為萃取溶劑。

2.2 萃取過程DOE摸索試驗設(shè)計

表3 加標(biāo)回收率的均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析

將萃取時間、萃取功率和萃取溶劑量進(jìn)行2k+4全因子試驗，試驗共進(jìn)行12次，可安排3個參數(shù)在低、高2個水平上的所有組合，參數(shù)及參數(shù)水平如表4所示。

因試驗均在相同條件下進(jìn)行，所以并未進(jìn)行區(qū)組化處理。隨機(jī)化處理試驗順序，試驗順序見表5中“實際試驗順序”列，“中心點(diǎn)”列中“是”代表此次試驗為中心點(diǎn)試驗，將測得的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果填至最后一列。

表4 萃取過程參數(shù)及參數(shù)水平設(shè)置

對表5試驗結(jié)果進(jìn)行分析，試驗結(jié)果的殘差符合正態(tài)性及隨機(jī)性要求（圖7），除考慮各參數(shù)對加標(biāo)回收率的影響之外，還應(yīng)考慮參數(shù)之間交互作用的影響，交互作用包括二階交互作用和三階交互作用。交互作用及分析結(jié)果如表6所示。

表5 全因子試驗表

表6中，“效應(yīng)”代表各參數(shù)取不同水平的均值之差，數(shù)值越大對加標(biāo)回收率的影響越顯著。“T”值為進(jìn)行T檢驗時，不同水平各“項”的均值與總體均值之差與平均值標(biāo)準(zhǔn)差之比，衡量各“項”影響的大小。在95%置信水平下，“P”值大于等于0.05代表參數(shù)對加標(biāo)回收率的影響不顯著，若小于0.05，則對加標(biāo)回收率有顯著影響。因此，萃取溶劑量，萃取時間和萃取溶劑量的交互作用，萃取時間、萃取功率和萃取溶劑量的三階交互作用影響都不顯著，可以將這幾項進(jìn)行簡化。

圖7 加標(biāo)回收率殘差圖

表6 摸索試驗因子分析表

表7為摸索試驗方差分析表。

從表7的方差分析可看到，3參數(shù)的交互作用P＞0.05，對加標(biāo)回收率的影響不顯著。另外從表6的“中心點(diǎn)”項和表7的“彎曲”項的“P”值來看，我們建立的試驗?zāi)Ｐ褪欠蔷€性的，存在彎曲。后續(xù)在精簡后，我們將用非線性的模型對試驗進(jìn)行擬合。

2.3 精簡后的萃取過程DOE試驗設(shè)計

對影響不顯著項進(jìn)行逐項刪除（非同時刪除，需看刪除后的模型是否變差），不再單獨(dú)研究它們對加標(biāo)回收率的影響，而是將它們列入殘差里進(jìn)行分析。精簡后，萃取時間、萃取功率以及它們的二階交互作用都是顯著的，“中心點(diǎn)”項或“彎曲”項也是顯著的，說明模型非線性。

2.4 響應(yīng)曲面設(shè)計摸索試驗

因在上述分析過程中發(fā)現(xiàn)擬合的模型是非線性的，所以使用響應(yīng)曲面進(jìn)行進(jìn)一步的分析來獲得因子的最佳水平。試驗設(shè)計及結(jié)果見表10。

對響應(yīng)曲面設(shè)計結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如表11所示。

表7 摸索試驗方差分析表

表8 精簡后試驗因子分析表

表9 精簡后試驗方差分析表

表10 響應(yīng)曲面試驗表

從表11的P值可看出，萃取溶劑量、萃取溶劑量的二次項、萃取時間和萃取功率的交互作用、萃取時間和萃取溶劑量的交互作用、萃取溶劑量和萃取功率的交互作用都是不顯著的。

表11 響應(yīng)曲面設(shè)計因子分析表

表12為響應(yīng)曲面設(shè)計摸索試驗方差分析表。

由表12可看到，模型的線性、平方和失擬都是顯著的，模型存在失擬現(xiàn)象，需要進(jìn)行優(yōu)化，參數(shù)間交互作用不顯著。

表12 響應(yīng)曲面設(shè)計摸索試驗方差分析表

2.5 響應(yīng)曲面設(shè)計精簡試驗

表13為響應(yīng)曲面設(shè)計因子分析。對不顯著項逐項進(jìn)行精簡，精簡后的數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果如表14所示。所有項都是顯著的，模型的失擬項不再顯著，說明精簡后模型可用。

表13 響應(yīng)曲面設(shè)計因子分析表

表14 精簡后響應(yīng)曲面設(shè)計方差分析表

對數(shù)據(jù)繪制曲面圖和等值線圖，見圖8和圖9。

由圖8和圖9可看到模型為曲面模型，且在萃取時間為24～48 min、萃取功率為110～450 W時，加標(biāo)回收率可達(dá)到90%以上。

圖8 響應(yīng)曲面設(shè)計曲面圖

圖9 響應(yīng)曲面設(shè)計等值線圖

用響應(yīng)優(yōu)化器對參數(shù)取值進(jìn)行優(yōu)化，在萃取時間取40 min，萃取功率取250 W時，加標(biāo)回收率為100.272 1，符合合意性為0.972 79，此時為擬合得到的參數(shù)的最優(yōu)水平，萃取溶劑量因影響不顯著，可取有利于試驗進(jìn)行的20 mL。

2.6 驗證試驗

按照萃取時間40 min、萃取功率250 W和萃取溶劑量為20 mL的參數(shù)水平，使用不含BIT的空白紙張以定量加標(biāo)的形式進(jìn)行驗證，結(jié)果見表15。

由表15可見，低、中、高含量的加標(biāo)回收率分別為92.9%、95.4%、90.8%。

3 結(jié)論

圖10 響應(yīng)優(yōu)化器

表15 方法驗證數(shù)據(jù)表

在對紙中BIT組分含量進(jìn)行測試的過程中，萃取過程的試驗優(yōu)化可以分成幾個步驟：對萃取溶劑選擇這個參數(shù)，可直接固定其他參數(shù)水平，然后進(jìn)行單因子方差分析，選擇加標(biāo)回收率的均值最大、標(biāo)準(zhǔn)差最小的二氯甲烷進(jìn)行萃取；其余的參數(shù)進(jìn)行全因子試驗設(shè)計，在摸索試驗后精簡對加標(biāo)回收率影響不顯著的參數(shù)及參數(shù)間的交互作用，因擬合的模型為非線性模型，使用響應(yīng)曲面設(shè)計及響應(yīng)優(yōu)化器選擇參數(shù)的最佳水平，分別為萃取時間40 min，萃取功率250 W，因萃取溶劑量影響不顯著，可在10～30 mL根據(jù)經(jīng)驗取方便實際操作的值，本試驗為更好地浸入試樣，萃取溶劑量取20 mL。按上述參數(shù)水平進(jìn)行驗證試驗，低、中、高含量試樣的加標(biāo)回收率均大于90%。