何杜朋， 陳錦桃， 崔旭蘭， 袁勁松

（1.南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳518000；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳518000）

銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，含有多種成分，如黃酮類、內(nèi)酯類、多糖類、酚類等，具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等生物活性[1，2]。近年來關(guān)于銀杏葉多糖的抗氧化活性研究表明，其對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子等具有較強(qiáng)清除作用[3，4]，又基于多糖類物質(zhì)具有較好的吸濕、保濕及營養(yǎng)肌膚等作用研究[5]，提示銀杏葉多糖在現(xiàn)代保健、護(hù)膚等產(chǎn)品開發(fā)方面具有一定的潛在價(jià)值。而有關(guān)銀杏葉多糖的保濕吸濕性能及透皮吸收性能的評(píng)價(jià)尚無研究報(bào)道。另有研究報(bào)道，丙三醇、海藻酸鈉具有良好的保濕吸濕功能，已廣泛應(yīng)用于美容護(hù)膚產(chǎn)品[6]。因此，本研究以其為對(duì)照，采用水提醇沉、Seveage法除蛋白、纖維素柱層析等方法制備銀杏葉多糖，測(cè)定其在不同相對(duì)濕度環(huán)境下的吸濕率、保濕率，同時(shí)通過離體透皮實(shí)驗(yàn)，分析評(píng)價(jià)其經(jīng)皮滲透能力，為其作為天然抗氧化劑的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器UV-1700雙光束紫外分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；YB-P6智能透皮試驗(yàn)儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；DL-720E超聲儀（上海之信儀器有限公司）；SC-3610低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；S30-UV實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；CP-225D電子天平（0.01mg）（德國賽多利斯公司）；ME-204電子天平（0.000 1 g）（瑞士梅特勒—托利多公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥 銀杏葉（批號(hào)：魯1702001），由江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司提供，經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院袁勁松主任中藥師鑒定，所用藥材符合《中華人民共和國藥典》2015版要求。D-無水葡萄糖對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201506）。其余試劑均為市售分析純。

1.3 動(dòng)物SPF級(jí)健康SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK（粵）2017-0125。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏葉多糖的制備[7]稱取銀杏葉干品100 g，先用石油醚提取至提取液無色，藥渣風(fēng)干后加入水加熱回流提取3次，1.5 h/次，過濾，濾液濃縮至適量，加入氯仿和正丁醇溶液混合液（V∶V=5∶1），振蕩，反復(fù)多次除去變性蛋白質(zhì)。在已脫蛋白溶液中加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇調(diào)至終濃度為80%，4℃靜置24 h，抽濾，沉淀物依次用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、無水乙醇洗滌2～3次，真空干燥至恒質(zhì)量，得到粗多糖8.36 g。再將粗多糖通過纖維素柱，蒸餾水洗脫，Molish反應(yīng)檢測(cè)至洗脫液呈陰性。合并洗脫液，濃縮至適量，用乙醇沉淀，4℃靜置24 h，抽濾，沉淀物依次用無水乙醇洗、丙酮洗滌2～3次，真空干燥，得到多糖4.28 g（多糖含量為2.94 g）。

2.2 吸濕性能研究[8，9]于室溫（25±1）℃，將飽和醋酸鉀溶液、飽和碳酸鉀溶液和飽和硫酸銨溶液分別放入干燥器內(nèi)，控制相對(duì)濕度（RH）為43%、60%、81%。準(zhǔn)確稱取3份銀杏葉多糖、丙三醇、海藻酸鈉，1.0 g/份，加入到直徑3 cm的稱量瓶中，再分別放置于以上干燥器內(nèi)，于1、2、4、8、12、16、24 h等不同時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定樣品放置前、后的質(zhì)量（m0、mn），計(jì)算吸濕率：吸濕率（%）=100（mn-m0）/m0。同時(shí)，以吸濕率為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制變化曲線，計(jì)算其趨勢(shì)線斜率k，即為樣品的吸濕速率。

RH43%的環(huán)境中，各樣品在0～24 h內(nèi)的吸濕率高低依次為丙三醇＞海藻酸鈉＞銀杏葉多糖，在24 h的吸濕率分別為81.2%、32.8%、27.5%。其中，丙三醇的吸濕率上升速度最快（k=9.434），而海藻酸鈉（k=3.088）與銀杏葉多糖（k=2.634）則是緩慢上升，且較為接近。吸濕率變化見圖1，趨勢(shì)線見表1。

圖1 RH43%時(shí)不同樣品的吸濕率變化情況（n=3）Figure 1 Comparison of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH43%（n=3）

表1 RH43%時(shí)不同樣品的吸濕率變化趨勢(shì)線Tabel1 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH43%

RH60%的環(huán)境中，各樣品在0～24 h內(nèi)的吸濕率高低依次為丙三醇＞海藻酸鈉≈銀杏葉多糖，在24 h的吸濕率分別為93.2%、35.7%、36.9%。其中，丙三醇的吸濕率上升速度依然最快（k=10.570），而海藻酸鈉（k=3.292）與銀杏葉多糖（k=2.788）則是緩慢上升，且較為接近。與RH42%環(huán)境相比，各樣品吸濕率均有所增加。吸濕率變化見圖2，趨勢(shì)線見表2。

圖2 RH60%時(shí)不同樣品的吸濕率變化情況（n=3）Figure 2 Com parison of themoisture-absorption rate of the differentsam ples atRH60%（n=3）

表2 RH60%時(shí)不同樣品的吸濕率變化趨勢(shì)線Table 2 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH60%

RH81%的環(huán)境中，各樣品在0～24 h內(nèi)的吸濕率高低依次為丙三醇＞銀杏葉多糖＞海藻酸鈉，在24 h的吸濕率分別為114.5%、47.2%、42.5%。其中，丙三醇的吸濕率上升速度仍是最快（k=13.270），而銀杏葉多糖（k=3.992）與海藻酸鈉（k=3.400）則表現(xiàn)為緩慢上升，且較為接近。與RH42%、RH60%環(huán)境相比，各樣品吸濕率均明顯增加，表明隨著環(huán)境相對(duì)濕度的增加，其吸濕效率也隨之提高。吸濕率變化見圖3，趨勢(shì)線見表3。

圖3 RH81%時(shí)不同樣品的吸濕率變化情況（n=3）Figure 3 Comparison of themoisture-absorption rate of the differentsam ples atRH81%（n=3）

表3 RH81%時(shí)不同樣品的吸濕率變化趨勢(shì)線Table 3 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsam p les atRH81%

2.3 保濕性能研究[8，9]各平行稱取3份銀杏葉多糖、丙三醇、海藻酸鈉，5 g/份，加入2 g超純水，混勻后稱取2 g于直徑3 cm的稱量瓶中，于室溫（25±1）℃置于裝有干硅膠的干燥器內(nèi)。于1、2、4、8、12、16、24 h等不同時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定樣品放置前、后的水分質(zhì)量（m0、mn），計(jì)算保濕率：保濕率（%）=100mn/m0。同時(shí)，以保濕率為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制變化曲線，計(jì)算其趨勢(shì)線斜率k，即為樣品的保濕速率。

干硅膠環(huán)境中，在0～24 h的保濕率高低依次為銀杏葉多糖＞海藻酸鈉＞丙三醇，在24 h的保濕率分別為63.6%、59.6%、42.5%，其中，丙三醇的下降速率最快（k=-6.676），海藻酸鈉次之（k=-5.221），銀杏葉多糖最慢（k=-4.359）。保濕率變化見圖4，趨勢(shì)線見表4。

2.4 多糖含量測(cè)定[10，11]

2.4.1 溶液制備 對(duì)照品溶液：稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品10.17mg于100mL容量瓶中，加入超純水溶解、定容，配制成質(zhì)量濃度為0.101 7mg/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液：稱取銀杏葉多糖15.22mg于100mL容量瓶中，加入生理鹽水超聲溶解、定容，配制成質(zhì)量濃度為0.152 2mg/mL的供試品溶液。

圖4 干硅膠環(huán)境中不同樣品的保濕率變化情況Figure 4 Com parison of themoisture-retention rate of the differentsam ples under dry silica gelcondition

表4 干硅膠環(huán)境中不同樣品的保濕率變化趨勢(shì)線Table 4 Trend line of themoisture-absorption rate of the differentsamp les under dry silica gelcondition

2.4.2 線性范圍考察 精確吸取D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分別加水至1.0mL，再加入5%苯酚溶液1.0mL、濃硫酸5.0 mL，沸水浴反應(yīng)15min；取出冷卻至室溫，平行操作3份。另取超純水1.0mL，加入同量的5%苯酚、濃硫酸，作為空白對(duì)照。于紫外分光光度計(jì)中490 nm波長處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)、D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=0.090 9X+0.032 1（R2=0.998 5），表明D-無水葡萄糖對(duì)照品在1.451～7.257μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度考察 精確吸取D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液0.3mL，平行3份，同法顯色反應(yīng)后連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算得平均吸光度值為0.421，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，sR）=0.49%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性考察 精確吸取供試品溶液0.3mL，平行6份，同法顯色反應(yīng)后測(cè)定吸光度值，計(jì)算得平均吸光度值為0.438，sR=0.92%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 精確吸取供試品溶液0.3mL，平行3份，同法顯色反應(yīng)后每隔1 h測(cè)定吸光度值，連續(xù)6 h，計(jì)算得平均吸光度值為0.440，sR=0.62%，表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率 精確吸取已知含量的供試品溶液0.3mL，平行6份，分別加入質(zhì)量濃度0.101 7 mg/mL的D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液0.3mL，同法顯色反應(yīng)后測(cè)定吸光度值，計(jì)算得平均回收率為98.63%，sR=0.92%，表明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.5 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)[12，13]將雄性大鼠處死，腹部脫毛后取其皮膚，去除脂肪等，生理鹽水沖洗干凈，剪成2.0 cm×2.0 cm大小。取大鼠皮膚角質(zhì)層向上，固定于Franz擴(kuò)散池的供給室與接受室之間，再往接受室中加入生理鹽水，排盡氣泡。準(zhǔn)確稱取濃度為5%、10%的銀杏葉多糖溶液1.0 g于供給室，鋪滿離體大鼠皮膚，敞口密封。設(shè)置水浴溫度（37±1）℃、轉(zhuǎn)速200 r/min，計(jì)時(shí)開始后于1、2、4、6、8、10、12、18、24 h等不同時(shí)間進(jìn)行取樣1.0mL，同時(shí)補(bǔ)加等量同溫的接受液。樣品溶液采用苯酚—硫酸法進(jìn)行顯色反應(yīng)，應(yīng)用紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)定多糖含量，計(jì)算單位面積的累積滲透量（Q）：。

其中Cm為第m個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度（μg·mL-1），V為接受液體積（17mL），Ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度（μg·mL-1），Vi為取樣體積，A表示釋藥面積（cm2）。

同時(shí)，以時(shí)間t為橫坐標(biāo)、藥物累積滲透量Q為縱坐標(biāo)，繪制累積滲透曲線，同時(shí)進(jìn)行線性回歸，所得Q-t直線方程的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率JSS，通過方程的截距可算得滯后時(shí)間Tlag，滲透系數(shù)K p=JSS/C（0C0為擴(kuò)散池中的藥物初始質(zhì)量濃度）。

由結(jié)果可知，在0～24 h內(nèi)，1%、5%、10%濃度的銀杏葉多糖均較為勻速地緩慢滲透，其中，穩(wěn)態(tài)透皮速率JSS、時(shí)滯Tlag均逐漸上升，而滲透系數(shù)K p及累積透過率則逐漸下降。三者相比，銀杏葉多糖溶液的滲透速率、時(shí)滯均隨濃度的提高而升高，但是滲透系數(shù)與累積滲透率卻隨著逐漸下降。見圖5、表5。

2.6 體外透皮吸收規(guī)律研究[14]以不同時(shí)間點(diǎn)的累積滲透量擬合零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Higuchi、Weibull、Hixson-Crowell、Ritger-Peppas等藥物釋放數(shù)學(xué)模型，比較r2值可知，1%、5%、10%的銀杏葉多糖均以Ritger-Peppas為最佳擬合模型（r2分別0.979 1、0.988 2、0.983 5），表明其體外透皮吸收規(guī)律符合Ritger-Peppas模型。具體結(jié)果見表6。

圖5 不同濃度銀杏葉多糖溶液在不同時(shí)間點(diǎn)的累積滲透量變化Figure 5 Changes of the cumulative permeability of Ginkgo biloba leaves polysaccharide solution w ith different concentrations atdifferent time points

3 討論

我國的銀杏葉產(chǎn)量占據(jù)世界的90%以上，資源十分豐富，且銀杏的葉、果和外種皮等部位均含有多糖。本研究立足于銀杏葉多糖的保濕吸濕、透皮吸收性能的評(píng)價(jià)，可為其在美容護(hù)膚方面的應(yīng)用提供依據(jù)，不僅可以更為顯著地提高銀杏葉的資源利用率，而且還能創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更大地調(diào)動(dòng)種植戶的積極性，具有重要的意義。

由于皮膚直接與空氣接觸，空氣中的濕度對(duì)于多糖能否發(fā)揮明顯的保濕吸濕效果起到關(guān)鍵性的影響。本研究體外模擬高濕、低濕以及干燥環(huán)境，考察銀杏葉多糖在不同相對(duì)濕度環(huán)境下的保濕吸濕性能變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：銀杏葉多糖隨著相對(duì)濕度（43%、60%、81%）的上升，吸濕率逐漸上升，顯示吸濕性能亦有所提高；與丙三醇、海藻酸鈉相比，銀杏葉多糖吸濕性能均弱于丙三醇，但與海藻酸鈉相近（中低濕度環(huán)境）甚至更優(yōu)（高濕度環(huán)境）；在干燥環(huán)境下，銀杏葉多糖的保濕性能則優(yōu)于其他二者。表明銀杏葉多糖的保濕吸濕性能較為均衡，可在不同環(huán)境中發(fā)揮不同作用，是一種性價(jià)比高、綜合性強(qiáng)的保濕劑。分析認(rèn)為，丙三醇為小分子，含有多個(gè)-OH，因此在吸濕方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的能力；而銀杏葉多糖（-OH等）與海藻酸鈉（-COONa、-OH等）均屬于多糖類物質(zhì)，分子量均較大，表現(xiàn)出相似的性能。

表5 不同濃度銀杏葉多糖的體外滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 Com parison of the parameters of penetration kinetics of the differentconcentrations of Ginkgo biloba leaves polysaccharose

表6 不同濃度銀杏葉多糖的藥物釋放數(shù)學(xué)模型擬合Table 6 Mathematicalmodel fitting for drug release of Ginkgo Biloba leaves polysaccharide w ith differentconcentrations

在體外經(jīng)皮吸收中發(fā)現(xiàn)，1%、5%、10%濃度的銀杏葉多糖溶液的滲透系數(shù)分別為28.89×10-5、7.56×10-5、4.11×10-5cm·h-1，表明不同濃度的銀杏葉多糖均能緩慢地經(jīng)皮滲透。其中在各時(shí)間點(diǎn)的單位面積滲透量、穩(wěn)態(tài)滲透速率、時(shí)滯方面，隨著濃度的升高，滲透量增加、速率升高、時(shí)間滯留量更多，表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系；而對(duì)于滲透系數(shù)與累積滲透率而言，則是隨著濃度的升高而降低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過對(duì)不同時(shí)間的累積滲透量進(jìn)行藥物釋放數(shù)學(xué)模型擬合發(fā)現(xiàn)，3個(gè)不同濃度的銀杏葉均以Ritger-Peppas模型的擬合度為最高，提示銀杏葉多糖在皮膚與接受液所構(gòu)成的骨架體系中進(jìn)行溶蝕擴(kuò)散與釋放。另外，銀杏葉多糖除了對(duì)皮膚具有保濕吸濕功能外，還能夠滲透入皮膚，發(fā)揮其他作用。