李增英， 趙恒俠， 劉雪梅， 渠昕， 李惠林

（深圳市中醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東深圳518033）

糖尿病（diabetesmellitus，DM）是一種以高血糖為特征的代謝紊亂綜合征。越來(lái)越多的證據(jù)表明，骨質(zhì)疏松是糖尿病的并發(fā)癥之一，在老年人群中普遍存在并且可能在未來(lái)繼續(xù)增加，其特征是骨質(zhì)和結(jié)構(gòu)惡化。1型糖尿病患者的整個(gè)生命過(guò)程與骨折風(fēng)險(xiǎn)增高密切相關(guān)[1]。Meta分析顯示1型糖尿病患者的骨密度（BMD）是降低的，其骨折風(fēng)險(xiǎn)大于2型糖尿病患者[2]。在分子水平上，細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和叉頭框蛋白（FoxO）轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)與骨丟失有關(guān)[3，4]。目前，miRNAs在糖尿病骨質(zhì)疏松（diabetic osteoporosis，DOP）發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。

微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，大小為22 nt，通過(guò)靶向mRNA的3’非編碼區(qū)（UTR）調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，導(dǎo)致mRNA降解和/或蛋白質(zhì)翻譯抑制[5]。研究表明，miRNAs參與骨質(zhì)疏松性骨折[6]。血清miRNAs微陣列顯示，miRNAs可作為生物標(biāo)志物區(qū)分2型糖尿病絕經(jīng)后婦女的分化性骨折狀態(tài)[7]。miR-378過(guò)表達(dá)可靶向Casp3激活磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號(hào)通路從而逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)成骨細(xì)胞活力和分化的抑制作用[8]。這些發(fā)現(xiàn)表明高糖條件下的miRNAs與骨質(zhì)疏松性骨折之間存在關(guān)聯(lián)。

滋腎降糖丸是由黃芪、生地黃、五味子、淫羊藿、枸杞子等14種中草藥組成的本院內(nèi)制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：粵Z20070085），具有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)腎壯骨的作用，符合從“腎主骨”理論入手治療骨質(zhì)疏松，是用于治療糖尿病的有效方劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，滋腎降糖丸具有明確的降糖調(diào)脂作用，且能提高胰島素敏感性，同時(shí)還能夠抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮、降低炎癥因子水平等[9，10]。在抗骨質(zhì)疏松方面，滋腎降糖丸能明顯改善DOP患者的臨床癥狀及體征，并且能調(diào)節(jié)患者的糖代謝紊亂，減少血清鈣磷流失，進(jìn)而改善骨代謝，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，提高骨密度[11，12]。而滋腎降糖丸含藥血清能通過(guò)下調(diào)人脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）及氧化物酶體增殖物激活受體γ2（PPARγ 2）的表達(dá)抑制小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成脂分化，上調(diào)Runx2和Bmp-2基因表達(dá)，促進(jìn)BMSCs成骨分化，發(fā)揮多靶點(diǎn)抗骨質(zhì)疏松作用[13，14]。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)滋腎降糖丸可通過(guò)改善糖代謝、骨代謝異常對(duì)DOP產(chǎn)生有益的作用，但滋腎降糖丸在糖尿病相關(guān)骨生成中作用的證據(jù)仍然有限。因此在本研究中，我們?cè)噲D證實(shí)滋腎降糖丸在DOP治療中的成骨作用，并通過(guò)miRNAs測(cè)序探討滋腎降糖丸治療是否可調(diào)節(jié)DOP大鼠骨組織miRNAs的表達(dá)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)7～8周齡健康雄性Wistar大鼠12只，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44005800005605，在廣州永諾生物SPF級(jí)別動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0186。

1.2 藥物與試劑 滋腎降糖丸（深圳市中醫(yī)院提供，批準(zhǔn)文號(hào)：粵Z20070085）。鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma公司）；羧甲基纖維素鈉（上海生工）。β-I型膠原羧基端肽（β-CTX）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、骨鈣素（OC）ELISA試劑盒（上海Usbiological公司）、骨硬化蛋白（sclerostin）ELISA試劑盒（上海ENZO公司）；Wako診斷甘油三酯（TG）試劑盒（molecular probes，美國(guó)Invitrogen公司）；Amplex?Red總膽固醇（TC）分析試劑盒（molecular probes，美國(guó)Invitrogen公司）；糖化血紅蛋白（HbAlc）試劑盒（瑞士Roche公司）；定量ELISA試劑盒（美國(guó)RD公司）；TRizol試劑（USA Thermo Scientific公司）；M1705 M-MLV Reverse Transcriptase、A6002 GoTaq?qPCR Master Mix（美國(guó)Promega公司）；TruSeq小RNA文庫(kù)制備試劑盒（Illumina，CA，USA）；M-MLVReverseTranscriptase試劑盒（北京Promega公司）；ChamQ SYBR qPCR MasterMix（南京Vazyme公司）。

1.3 儀器 血糖檢測(cè)儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）；高速臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；W81507Hologic DXA設(shè)備（美國(guó)Hologic Discovery公司）；雙能X線骨密度儀（美國(guó)GE公司）；HemaTGL-16R冷凍高速離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；Illumina HiSeq平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）；TaqMan 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.4 DOP模型的構(gòu)建與給藥 將12只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后以抽簽法隨機(jī)分為正常組、模型組和滋腎降糖丸組，每組4只。正常組大鼠給予腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液，模型組和滋腎降糖丸組大鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素STZ（55mg/kg）。連續(xù)注射1周后，禁食12 h后剪尾采血測(cè)量空腹血糖，選取空腹血糖達(dá)到16.7mmol/L的大鼠被判斷為造模成功。滋腎降糖丸組給予滋腎降糖丸水溶液（劑量為1.5 g·kg-1·d-1）灌胃，正常組、模型組給予等劑量5.0 g/L羧甲基纖維素鈉（為滋腎降糖丸溶劑）灌胃。灌胃治療8周后脫頸處死大鼠[12]。

1.5 生化檢測(cè) 各組大鼠最后1次灌胃后隔夜禁食12 h，次日清晨采血、離心、取血清。采用ELISA法檢測(cè)血清β-CTX、OC、骨硬化蛋白、TG、TC和HbAlc含量。血糖檢測(cè)儀測(cè)定空腹血漿葡萄糖（FPG）水平。

1.6 骨密度檢測(cè) 給藥結(jié)束后，處死大鼠并分離左側(cè)股骨，應(yīng)用雙能X線骨密度儀及小動(dòng)物專用軟件檢測(cè)分析BMD。測(cè)量參數(shù)為雙能電壓41 kVp和100 kVp，掃描窗寬18 cm，掃描速率4.8 s/cm。

1.7 RNA測(cè)序 應(yīng)用TRizol試劑提取股骨近端的組織總RNA。使用TruSeq小RNA文庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建小RNA文庫(kù)。RNA-seq在Illumina HiSeq平臺(tái)上進(jìn)行。測(cè)序原始數(shù)據(jù)去接頭去冗余后剩余的序列與人類基因組（hg19）比對(duì)，并通過(guò)miRBase（http：//www.mirbase.org/）用于miRNAs鑒定和注釋。

1.8 生物信息學(xué)分析 使用Deseq2鑒定差異表達(dá)的miRNAs符合差異倍數(shù)≥1.5并且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05標(biāo)準(zhǔn)的miRNAs被鑒定為差異表達(dá)的miRNAs。使用KOBAS軟件進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes，KEGG）富 集 分析。此外，使用miRanda軟件預(yù)測(cè)miRNAs的mRNA靶標(biāo)，使用Cytoscape繪制miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。

1.9 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 使用TRizol試劑提取股骨近端組織的總RNA，使用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒對(duì)分離的總RNA進(jìn)行定量并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄分析。使用ChamQ SYBR qPCRMasterMix在TaqMan 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上擴(kuò)增得到的cDNA。采用2-ΔΔct方法計(jì)算miRNAs的相對(duì)表達(dá)（p）。本研究所用引物如表1所示。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用Fisher LSD方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滋腎降糖丸干預(yù)對(duì)DOP大鼠糖脂代謝和骨代謝的影響 檢測(cè)各組糖代謝指標(biāo)FPG、HbA1c、TG、TC，骨吸收標(biāo)志物β-CTX、骨硬化蛋白，骨形成相關(guān)參數(shù)OC、BMD。圖1結(jié)果顯示：STZ誘導(dǎo)上調(diào)模型大鼠糖脂代謝指標(biāo)FPG、HbA1c、TG、TC及骨吸收標(biāo)志物β-CTX、骨硬化蛋白水平，下調(diào)骨形成相關(guān)參數(shù)OC、BMD水平。滋腎降糖丸處理則可抑制STZ誘導(dǎo)的FPG、HbA1c、TG、TC、β-CTX、骨硬化蛋白的上調(diào)以及OC、BMD的下調(diào)，使之恢復(fù)到正常組水平。

2.2 滋腎降糖丸干預(yù)對(duì)DOP大鼠miRNAs表達(dá)的影響RNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示：比較正常組和模型組以及模型組和滋腎降糖丸組這2個(gè)數(shù)據(jù)集中有199個(gè)共同差異表達(dá)的miRNAs（圖2-a）。將199個(gè)miRNAs中符合模型組較正常組上調(diào)同時(shí)滋腎降糖丸組較模型組下調(diào)，模型組較正常組下調(diào)同時(shí)滋腎降糖丸組較模型組上調(diào)的55個(gè)miRNAs在3組樣品繪制表達(dá)熱圖（圖2-b）。預(yù)測(cè)這些miRNAs的候選靶基因并對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG和GO分析，結(jié)果顯示miRNAs靶基因主要富集在PI3K-Akt、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、FoxO、Rap1、Wnt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、糖基化終產(chǎn)物—糖基化終產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）、細(xì)胞循環(huán)（cell cycle）等信號(hào)通路（圖2-c）。GO分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNAs靶基因參與細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、脂類反應(yīng)、胰島素反應(yīng)、葡萄糖反應(yīng)等生物學(xué)功能過(guò)程（圖2-d）。

表1 QRT-PCR引物列表Table 1 QRT-PCR primer sequnces

圖1 各組糖脂代謝指標(biāo)、骨吸收標(biāo)志物、骨形成相關(guān)參數(shù)比較Figure 1 Comparison ofglucose and lipidmetabolism indexes，bone absorptionmarkers，and bone formation parameters in various groups（）

挑選GO分析圖中條目中最多的10個(gè)miRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示：miR-26a-5p在模型組較正常組上調(diào)（P＜0.05），在滋腎降糖丸組下調(diào)至正常組水平（P＞0.05）。miR-343、miR-184和miR-295-3p在模型組較正常組下調(diào)（P＜0.01），在滋腎降糖丸組上調(diào)恢復(fù)至正常組水平（P＞0.05）。這4個(gè)miRNAs的qPCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。而miR-151-5p、miR-138-5p、miR-196c-5p在3組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，miR-200c-3p在模型組較正常組有上調(diào)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而其在滋腎降糖丸組較模型組顯著下調(diào)。miR-200a-5p在模型組較正常組有下調(diào)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在滋腎降糖丸組較模型組顯著上調(diào)。miR-547-3p在模型組較正常組顯著下調(diào)，在滋腎降糖丸組相比模型組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見圖3。

2.3 生物信息學(xué)分析滋腎降糖丸處理后差異表達(dá)miRNAs功能 使用軟件繪制測(cè)序和qPCR檢測(cè)一致的miR-26a-5p，miR-343、miR-184和miR-295-3p與靶mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)。如圖4所示，這4個(gè)miRNAs的靶基因的功能主要與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、胰島素反應(yīng)和糖脂反應(yīng)等有關(guān)。

3 討論

本研究中，我們觀察到滋腎降糖丸干預(yù)后顯著抑制STZ誘導(dǎo)DOP模型大鼠所引起的TG、TC、FPG和HbA1c等糖脂代謝指標(biāo)和骨吸收參數(shù)β-CTX和骨硬化蛋白升高，同時(shí)骨形成參數(shù)OC和BMD下調(diào)。miRNAs表達(dá)譜分析顯示，一部分在模型組大鼠中差異表達(dá)的miRNAs在滋腎降糖丸處理后部分或全部恢復(fù)，且功能預(yù)測(cè)顯示這部分miRNAs是與調(diào)節(jié)糖脂代謝和細(xì)胞行為有關(guān)的mRNA，提示miRNAs可能參與調(diào)節(jié)滋腎降糖丸對(duì)DOP的保護(hù)作用。

圖2 滋腎降糖丸干預(yù)后DOP大鼠m iRNAs表達(dá)特征Figure 2 The characteristics ofm iRNAs expression in DOP rats after ZJP treatment

圖3 QRT-PCR驗(yàn)證m iRNAs的表達(dá)Figure 3 QRT-PCR verifying the expression ofm iRNAs

圖4 R軟件繪制m iRNA-m RNA互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 MiRNA-mRNA interaction network drawn by R software

骨質(zhì)疏松與中醫(yī)理論中“骨萎”“骨枯”等病類似?；凇澳I主骨”的傳統(tǒng)理論，DOP的病因病機(jī)正是由于消渴陰虛內(nèi)熱，燥熱耗傷腎陰，久病傷氣，腎精匱乏，氣虛失攝，腎精虛衰流失，骨失滋養(yǎng)，骨枯髓減，則骨體枯槁，骨質(zhì)脆弱疏松無(wú)力而發(fā)為“骨萎”“骨枯”等。治療上采用滋陰補(bǔ)腎、益精填髓等方法，往往能取得較好的療效。滋腎降糖丸是本院自行研發(fā)的中藥復(fù)方，具有益氣養(yǎng)陰、滋腎壯骨的作用，符合從“腎主骨”理論入手治療骨質(zhì)疏松。前期研究證實(shí)滋腎降糖丸可通過(guò)改善糖代謝、骨代謝異常對(duì)DOP產(chǎn)生有益作用，臨床研究證實(shí)滋腎降糖丸不僅能改善DOP患者中醫(yī)證候積分以及血鈣、血磷等礦物質(zhì)，對(duì)OC、骨保護(hù)素（OPG）、β-CTX、骨硬化蛋白等骨代謝相關(guān)因子亦有改善作用[11，12]；而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則證實(shí)滋腎降糖丸含藥血清能促進(jìn)BMSCs成骨分化，抑制成脂分化[9，10，13-15]。

HbA1c和FPG是糖尿病篩查的2個(gè)重要的葡萄糖代謝標(biāo)志物[16]。高水平的HbA1c和FPG常與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的縱向風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[17-19]。本研究結(jié)果顯示滋腎降糖丸組中HbA1c和FPG水平較模型組下調(diào)，表明滋腎降糖丸可改善糖代謝，從而降低糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。β-CTX是骨吸收標(biāo)志物，既往研究表明β-CTX水平高的DM患者骨質(zhì)流失增加，可作為評(píng)估骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物[20]。骨硬化蛋白是骨形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子，幾乎完全由骨細(xì)胞產(chǎn)生[21]，抑制骨硬化蛋白可逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)流失，同時(shí)減少骨質(zhì)疏松癥大鼠模型中的骨吸收[22]。在骨形成過(guò)程中由成骨細(xì)胞分泌的OC是骨的有機(jī)成分之一，其高表達(dá)使其成為骨形成的常用生物標(biāo)志物[23]。BMD是一種骨形成標(biāo)記，不僅反映了骨量，還反映了骨的礦化程度[24]。本研究中，滋腎降糖丸干預(yù)可改善DOP模型大鼠糖脂代謝、抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成，說(shuō)明滋腎降糖丸在DOP的治療中可發(fā)揮降糖、改善血脂、抗骨質(zhì)疏松的多靶點(diǎn)作用。

進(jìn)一步的RNA-seq分析結(jié)果顯示，STZ誘導(dǎo)可影響大鼠的miRNAs表達(dá)，而滋腎降糖丸干預(yù)則恢復(fù)了部分miRNAs的表達(dá)。我們采用qPCR方法驗(yàn)證了滋腎降糖丸干預(yù)能恢復(fù)STZ誘導(dǎo)的DOP大鼠引起的miR-26a-5p、miR-343、miR-184和miR-295-3p表達(dá)水平的變化。其中，miR-26a-5p可作為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的抑制劑，與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展有關(guān)，可能參與調(diào)節(jié)人體內(nèi)軟骨穩(wěn)態(tài)的維持[25]。在我們的研究中，miR-26a-5p的表達(dá)變化及滋腎降糖丸處理后的恢復(fù)表明miRNAs在滋腎降糖丸治療效果中的作用。此外，對(duì)這些差異miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖譜的分析顯示，這些miRNAs的功能與糖脂代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化有關(guān)，表明滋腎降糖丸干預(yù)所引起的miRNAs表達(dá)變化可能與這些功能有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)滋腎降糖丸干預(yù)可以改善DOP大鼠的糖脂代謝、抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成。同時(shí)，STZ誘導(dǎo)的DOP大鼠模型中存在一系列差異表達(dá)的miRNAs，這些差異表達(dá)的miRNAs主要富集在糖代謝、脂代謝和細(xì)胞凋亡有關(guān)的通路上，提示miRNAs可能參與滋腎降糖丸治療對(duì)糖脂代謝和骨代謝穩(wěn)態(tài)的保護(hù)作用。但由于本研究樣本量較小，所得出的結(jié)論存在一定的局限性，有待于今后擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的探討。