江波， 孫勤國(guó)， 謝萍， 施燕， 黃天慧

（1.武漢大學(xué)同仁醫(yī)院/武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，湖北武漢430060；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）的慢性微血管并發(fā)癥，也是最終導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因[1]。其在糖尿病并發(fā)癥中占30%～40%[2]。因此，加強(qiáng)糖尿病及其并發(fā)癥糖尿病腎病的治療研究具有重要意義。中醫(yī)藥治療糖尿病腎病具有療效溫和、持久、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)。濟(jì)生腎氣丸出自宋代嚴(yán)用和《濟(jì)生方》，有溫腎陽(yáng)、散瘀結(jié)、行氣利水的作用[3]。本課題組以此方為基礎(chǔ)加減變化，臨床應(yīng)用加味濟(jì)生腎氣湯治療糖尿病腎病有明顯療效，但其作用機(jī)制尚不清楚。故本研究觀(guān)察不同劑量的加味濟(jì)生腎氣湯對(duì)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎臟功能的保護(hù)作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物66只SPF級(jí)日齡90 d雌性SD大鼠，體質(zhì)量為（232.5±14.3）g，購(gòu)于湖北省疾病預(yù)防控制中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42000600026493。飼養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫23℃左右，自然光源，自由飲水。

1.2 藥物 加味濟(jì)生腎氣湯方藥組成：肉桂6 g，制附片8 g，熟地15 g，山藥25 g，山茱萸15 g，茯苓20 g，澤瀉8 g，丹皮8 g，懷牛膝15 g，車(chē)前子10 g，黃芪25 g，熟大黃8 g，桃仁10 g，穿山甲25 g。方中中藥材均采購(gòu)于武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部。加水1 000mL，水煎2遍，煎煮至200mL備用。

1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素（STZ）（購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司）；血糖酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）測(cè)試盒、胰島素（INS）ELISA測(cè)試盒、糖化血紅蛋白（HbA1c）ELISA測(cè)試盒、尿素氮（BUN）ELISA測(cè)試盒、內(nèi)皮素（ET-1）ELISA測(cè)試盒、微量白蛋白尿（UmAlb）ELISA測(cè)試盒、ELISA測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；血清胱抑素C（Cys-C）ELISA測(cè)試盒（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）；血肌酐（SCr）ELISA測(cè)試盒（上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司）。ELx800TM酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；Leica RM2235石蠟切片機(jī)（中國(guó)上海徠卡公司）。

1.4 分組、造模與給藥 將大鼠隨機(jī)分成正常組（N=11），造模組（N=55）。2組適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，進(jìn)行模型的構(gòu)建和相應(yīng)處理。造模方法：給予大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料（含豬油20%、白糖20%、蛋黃粉6%、基礎(chǔ)飼料54%）5周后，禁食12 h，腹腔注射劑量為25 mg/kg的鏈脲佐菌素（STZ），每天1次，注射3 d。檢測(cè)空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG含量＞11mmol/L，即表明糖尿病腎病模型復(fù)制成功[4]。統(tǒng)計(jì)成模率，未成模者予剔除實(shí)驗(yàn)。再將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、羥苯磺酸鈣組，中藥低、中、高劑量組。將備用的加味濟(jì)生腎氣湯按照灌胃劑量稀釋到10mL，中藥低、中、高劑量組給予加味濟(jì)生腎氣湯（劑量分別為0.94、3.76、9.40 g·kg-1·d-1）灌胃。羥苯磺酸鈣組灌胃羥苯磺酸鈣100mg·kg-1·d-1。正常組、模型組等體積生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)6周。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)與方法

1.5.1 觀(guān)察大鼠一般情況 觀(guān)察大鼠精神狀態(tài)、毛色、飲水量、攝食量、尿量，統(tǒng)計(jì)并記錄各組大鼠體質(zhì)量，對(duì)外界刺激的反應(yīng)、死亡情況等。

1.5.2 免疫比濁法檢測(cè)24 h尿微量白蛋白（24hUmAlb）含量 采用代謝籠收集動(dòng)物24 h尿液（每籠動(dòng)物3～5只），計(jì)量尿量。按尿總蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，簡(jiǎn)要步驟如下：使用8孔板，每孔加入200μL試劑R1，之后每孔加入10μL樣品或者標(biāo)準(zhǔn)品，37℃下孵育10min，于600 nm處讀取吸光度（D）。按標(biāo)準(zhǔn)品繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品尿蛋白濃度。平均每只動(dòng)物的24 h尿蛋白總量=樣品尿蛋白濃度×尿量/動(dòng)物只數(shù)。

1.5.3 ELISA法檢測(cè)FBG、INS、BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c水平 藥物干預(yù)結(jié)束、空腹12 h后，給予大鼠100 g/mL水合氯醛腹腔注射麻醉（劑量為0.3mL/100 g）。用組織剪沿腹中線(xiàn)剪開(kāi)皮膚、肌肉，充分暴露腹腔，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血。以3 000 r/min離心10min，分離血漿和血清，抗凝標(biāo)本。血漿用于HbA1c檢測(cè)，血清用于BUN、SCr、Cys-C、ET-1的檢測(cè)，所有檢測(cè)均在室溫下2 h內(nèi)檢測(cè)完畢。ELISA法操作步驟：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品、酶標(biāo)試劑及生物素標(biāo)記的抗體，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品40μL，然后再加生物素標(biāo)記的抗體10μL。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育30min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min。每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)。

1.5.4 蘇木素—伊紅（HE）染色觀(guān)察腎組織病理變化 將大鼠腎臟組織經(jīng)過(guò)脫水，包埋，以6μm的厚度均勻切片。將蘇木精加入蒸餾水內(nèi)加溫溶解，冷卻后加入酒精和甘油，備用。石蠟切片脫蠟至水。用蘇木精液染核7min。置于容器中，流水沖洗2 h。以1%的鹽酸酒精溶液分化3 s，用伊紅染液染色5～10min。用體積分?jǐn)?shù)95%酒精、無(wú)水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病腎病大鼠成模率55只大鼠，共有47只大鼠造模成功，其中8只大鼠注射STZ后血糖仍未達(dá)到16.7mmol/L，予以剔除，成模率為85.5%。0只大鼠在高糖高脂飼料喂養(yǎng)期間死亡。中藥中劑量組1只在STZ注射后，藥物治療第5周死亡，死亡率為2%。最終共46只大鼠參與造模后的實(shí)驗(yàn)，其中：模型組，10只；羥苯磺酸鈣組，9只；中藥低劑量組，10只；中藥中劑量組，9只；中藥高劑量組，9只。

2.2 各組大鼠一般情況比較 正常組大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)濃密均勻有光澤，反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量顯著增加。模型組大鼠精神狀態(tài)較差，反應(yīng)緩慢，毛發(fā)粗糙而凌亂無(wú)光澤，多飲、多食、多尿癥狀比較明顯，形體消瘦。中藥高、中、低劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)以及反應(yīng)情況略差于正常組大鼠，體質(zhì)量增長(zhǎng)速度較慢，后期上述癥狀有所緩解。

2.3 治療結(jié)束后各組大鼠體質(zhì)量值比較 在治療第5周結(jié)束時(shí)，檢測(cè)各組大鼠的體質(zhì)量值，結(jié)果見(jiàn)圖1。與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，羥苯磺酸鈣組，中藥中、高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05）；中藥低劑量組大鼠體質(zhì)量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示加味濟(jì)生腎氣湯可提高糖尿病腎病大鼠體質(zhì)量，且呈劑量依賴(lài)性。

圖1 治療結(jié)束后各組大鼠體質(zhì)量值比較Figure 1 Com parison of the ratbodymass values in various groups after treatmentending（）

2.4 各組大鼠FBG、INS水平比較 圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠FBG、INS水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組大鼠FBG、INS水平均顯著降低（P＜0.05）。提示加味濟(jì)生腎氣湯可改善糖尿病腎病大鼠FBG、INS水平，且呈劑量依賴(lài)性。

2.5 各組大鼠腎功能比較 圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c及24hUmAlb水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和羥苯磺酸鈣組的BUN、SCr、Cys-C、ET-1、HbA1c及24hUmAlb水平均顯著降低（P＜0.05）。提示加味濟(jì)生腎氣湯可改善糖尿病腎病大鼠腎功能，且呈劑量依賴(lài)性。

圖2 各組大鼠FBG、INS水平比較Figure 2 Com parison of the levels of FBG and INS in various groups（）

2.6 各組大鼠腎組織病理變化比較 圖4結(jié)果顯示：模型組腎小球體積增加，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生，系膜區(qū)變寬，基底膜增厚，毛細(xì)血管環(huán)增多，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，融合，壞死，腎小球系膜區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。中藥中、高劑量組以上癥狀均得到明顯改善，中藥低劑量組改善不明顯。

3 討論

圖3 各組大鼠腎功能比較Figure 3 Com parison of the renal function in various groups（）

圖4 各組大鼠腎組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 4 Com parison of the pathologicalchanges of kidney tissues in various groups（by HE staining，×200）

糖尿病腎病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，缺乏有效治療和控制會(huì)導(dǎo)致終末期腎病（ESRD）的發(fā)生[5，6]。早期糖尿病腎病最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一是尿白蛋白排出量的增加[7]，一旦出現(xiàn)臨床蛋白尿[尿微量白蛋白（UmAlb）＞0.5 g/24 h]，腎小球功能則呈進(jìn)行性下降，若出現(xiàn)大量蛋白尿，則逐漸出現(xiàn)腎功能損害。24 hUmAlb為糖尿病腎病嚴(yán)重程度的衡量標(biāo)志之一，加速腎臟病變的進(jìn)展，因此降低蛋白尿可以減少腎臟的持續(xù)損傷[8-10]。血液生化指標(biāo)BUN、SCr常用于指示糖尿病腎病炎性和腎臟功能狀態(tài)。SCr水平的升高、體質(zhì)量的增加、血糖的升高等都是蛋白尿發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，加味濟(jì)生腎氣湯可顯著降低糖尿病腎病大鼠BUN、SCr、24 hUmAlb水平，提示加味濟(jì)生腎氣湯可有效改善糖尿病腎病大鼠腎功能。

Cys-C是由122個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量約為13 kDa的低分子蛋白質(zhì)，廣泛存在于體液和有核細(xì)胞內(nèi)[11]。亦是一種不受血脂、年齡等干擾的半胱氨酸蛋白酶抑制物，能自由地通過(guò)腎小球，在近曲小管處被降解，不再回到血液中。腎小管不能分泌Cys-C，腎臟是清除Cys-C在體內(nèi)循環(huán)的唯一器官，故Cys-C可作為評(píng)價(jià)腎功能的指標(biāo)[12，13]，能夠很好地反映腎臟的濾過(guò)功能。本研究結(jié)果顯示，加味濟(jì)生腎氣湯可顯著降低Cys-C的含量，提示加味濟(jì)生腎氣湯能提高STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠腎臟的濾過(guò)功能。

內(nèi)皮素（ET-1）是作用最強(qiáng)的血管舒縮因子之一，與糖尿病早期腎小管間質(zhì)損傷密切相關(guān)[14，15]，正常生理情況下，ET-1水平很低，但在病理狀態(tài)下，高血糖、高脂血癥或受刺激后ET-1局部合成增多[16]。HbA1c和腎小球?yàn)V過(guò)率的縱向變化可精確地預(yù)測(cè)早期糖尿病腎病的發(fā)生，HbA1c能反映1～2個(gè)月前的平均血糖水平，是反映糖尿病較長(zhǎng)時(shí)間血糖控制水平的良好指標(biāo)[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，ET-1和HbA1c水平在正常組、中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組和模型組間呈現(xiàn)依次升高的變化趨勢(shì)。說(shuō)明加味濟(jì)生腎氣湯對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。在病理組織學(xué)方面，加味濟(jì)生腎氣湯可明顯改善糖尿病腎病大鼠腎組織病理?yè)p傷。