劉廷薇，陳雪珂，馬良，戴宏杰，余永，周鴻媛，郭婷，張宇昊

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

明膠是一種變性纖維蛋白，通過部分熱水解從膠原中獲得，它是一種重要的功能性生物高聚物，因其生物具有相容性和親水性等屬性，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、制藥和攝影行業(yè)[1-3]。明膠在熱水提取之前通常需要進(jìn)行明膠化處理[4]。在明膠化的過程中，膠原中的共價交聯(lián)和次級鍵被破壞，膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)變得疏松，非螺旋結(jié)晶區(qū)被破壞，使后續(xù)的提膠過程中膠原亞基分子更容易釋放[5]。

目前，我國明膠生產(chǎn)主要采用酸堿法，酸堿的使用目的主要是破壞膠原中的共價鍵和部分次級鍵，使膠原的亞基組分可以在熱水提膠過程中被釋放，形成明膠。但酸堿的大量使用造成了明膠生產(chǎn)過程的高污染，我國明膠企業(yè)規(guī)模較小，高額的污水處理系統(tǒng)建設(shè)和運(yùn)行成本嚴(yán)重限制了我國明膠企業(yè)產(chǎn)能的擴(kuò)大和產(chǎn)品的市場競爭。因此，明膠行業(yè)污染和高效生產(chǎn)問題的解決歸根到底要從工藝入手，做到高效清潔生產(chǎn)，才能促使我國明膠行業(yè)健康、快速發(fā)展。

2000年以后，酶法制備明膠成為明膠制備工藝改進(jìn)的主要方向[6]，主要是利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等的破壞原料中雜蛋白和膠原蛋白的非螺旋區(qū)，使三螺旋結(jié)構(gòu)松散，有利于后期熱水提膠。但酶法明膠始終存在小分子組分含量高，明膠凝膠強(qiáng)度低的問題，使之無法在產(chǎn)業(yè)化中應(yīng)用[7-8]。近年來，出現(xiàn)了一些誘導(dǎo)膠原明膠化新方法，CHEN等[9]通過超高壓協(xié)同稀酸法制備豬皮明膠，結(jié)果表明經(jīng)該法明膠化后提取的豬皮明膠得率最高可達(dá)63%(以羥脯氨酸含量計)，凝膠強(qiáng)度大多在375～400 g，該法誘導(dǎo)膠原蛋白明膠化的機(jī)理在于超高壓破壞原料膠原中氫鍵的平衡，松散膠原分子的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時促進(jìn)稀酸向原料中滲透，并快速破壞膠原分子間共價交聯(lián)[10]。但該法受限于設(shè)備與連續(xù)化生產(chǎn)等問題，難以有效實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

本課題組在膠原明膠化新型工藝的方法上嘗試了液氮快速冷凍結(jié)合稀酸解凍誘導(dǎo)豬皮膠原明膠化的方法[11]，發(fā)現(xiàn)液氮處理結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HCl溶液的解凍后能有效提取明膠，其明膠得率為18.44%(以原料濕重計)，凝膠強(qiáng)度可達(dá)368.0 g。原因在于快速凍融過程是水變成冰再快速變成水的過程，存在體積的快速變化，膠原分子中的不易流動水轉(zhuǎn)化成冰時體積增加，快速融化后體積又迅速減小。這一過程中，膠原分子三螺旋結(jié)構(gòu)可能因冰的形成快速膨脹而松散，但融化時，膠原分子又不能盡快復(fù)原，同時加之酸的介入破壞了分子間共價交聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)了快速明膠化，這一方法具有實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的前景。

但目前對于凍融法明膠的理化性質(zhì)尚缺乏全面研究與評價，本研究通過對凍融法明膠基本理化性質(zhì)，明膠亞基組成，氨基酸組成，全質(zhì)構(gòu)，流體特性，色差，起泡性和泡沫穩(wěn)定性等指標(biāo)的測定，并與傳統(tǒng)酸法明膠作對比，對快速凍融豬皮明膠的理化性質(zhì)進(jìn)行全面評價，旨在為其在明膠的生產(chǎn)加工和應(yīng)用方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

豬皮，購于重慶市北碚區(qū)城南新世紀(jì)超市；液氮、HCl、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)，成都市科龍試劑廠；考馬斯亮藍(lán)R-250，BIO BASIC公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白(分子質(zhì)量10～200 kDa)，加拿大Fermentas公司；丙烯酰胺(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)，北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SHZ-B水浴恒溫振蕩器，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；4-6型馬弗爐，北京市永光明儀器廠；HX-1005恒溫循環(huán)器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TA.XT2i物性測定儀，英國Stable Micro System公司；Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀，美國Bio-Rad公司；DHR-1流變儀，美國TA公司；752型紫外可見分光光度計，上海箐華科技有限公司；FSH-Ⅱ高速勻漿機(jī)，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；L-8900型全自動氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

豬皮明膠具體制備流程如下：

豬皮→清洗、剪碎→脫脂→清洗→除雜蛋白→清洗、瀝干→明膠化處理(傳統(tǒng)酸處理或液氮凍融)→熱水提膠→過濾、烘干

(1)清洗、剪碎：豬皮清洗后，用刀刮去表面的毛和脂肪，剪成4 mm×4 mm塊狀。

(2)脫脂：按1∶2.5料液比將豬皮浸泡于7.5 g/L的SDBS溶液中超聲脫脂(2 h、120 W、25℃)。

(3)除雜蛋白：將豬皮浸泡于10 g/L的NaCl溶液中，料液比1∶5，磁力攪拌6 h(每2 h換一次溶液)。

(4)明膠化處理：本實(shí)驗(yàn)明膠化處理有2種方式，即傳統(tǒng)酸法處理或快速凍融處理。

①傳統(tǒng)酸法處理：按1∶10料液比將豬皮加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HCl溶液中，間斷攪動處理6 h，然后沖洗至pH 4～5，以備提膠。

②快速凍融處理：將豬皮用液氮速凍后，立即用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HCl溶液在40℃條件下水浴解凍20 min，料液比為1∶10，期間不斷攪拌，然后沖洗至pH 4～5，以備提膠。

(5)熱水提膠：以3倍原料體積加入去離子水，60℃水浴振蕩提取6 h。

(6)過濾、烘干：膠液過濾后，倒入塑料盤中，60℃烘干即可。

1.4 分析方法

1.4.1 明膠理化性質(zhì)分析

1.4.1.1 明膠基本理化性質(zhì)的測定

蛋白質(zhì)含量按照GB 5009.5—2010[12]凱氏定氮法測定；水分和灰分分別依照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[13]直接干燥法和GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》[14]馬弗爐高溫灼燒法進(jìn)行測定；透明度依照GB 6783—2013《食品添加劑明膠》[15]分光光度法進(jìn)行測定。

1.4.1.2 明膠色差的測定

配制66.7 g/L的傳統(tǒng)酸法明膠溶液和凍融法明膠溶液在(10±0.1)℃恒溫循環(huán)器內(nèi)冷凝過夜。用白標(biāo)板與黑標(biāo)板矯正色差儀，然后測定樣品的色差。

1.4.2 明膠亞基組成

向明膠中加入去離子水，靜置1 h后于60 ℃下水浴溶解，得到1.5 g/L明膠樣品溶液。按照V(樣品溶液)∶V(上樣緩沖液)=4∶1加入5×還原性樣品緩沖液，渦旋后煮沸5 min，立即冷卻上樣，樣品15 μL，標(biāo)準(zhǔn)蛋白10 μL。SDS-PAGE濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%。設(shè)置初始電流為15 mA開始電泳，當(dāng)藍(lán)色條帶移至分離膠中電流增大到25 mA，當(dāng)藍(lán)色條帶達(dá)到凝膠底層時電泳完成。取出凝膠加入考馬斯亮藍(lán)染色2 h，之后加脫色液至背景完全透明。

1.4.3 氨基酸組成分析

向水解管中加入20 mg明膠粉末和10 mL，6 mol/L的HCl溶液，抽真空后(110±1)℃沙浴水解22 h，冷卻到室溫，將水解液過濾，加去離子水定容到50 mL。取1 mL稀釋后的濾液，蒸干多余溶劑后加入1 mL、pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，振蕩混勻，通過0.22 μm針孔過濾膜后即可用全自動氨基酸分析儀測定。

1.4.4 明膠全質(zhì)構(gòu)測定

配制66.7 g/L的明膠溶液,于(10±0.1)℃的恒溫循環(huán)器中冷卻16～18 h，用TA.XT2i物性測定儀測定其質(zhì)構(gòu)特性。SMSP/0.5圓柱型探頭，下壓距離4 mm，下壓速度1 mm/s。

1.4.5 明膠功能特性

1.4.5.1 明膠流體特性測定

使用DHR-1流變儀分別測定66.7 g/L傳統(tǒng)酸法和凍融法明膠溶液在40℃條件下剪切速率在0～50 s-1對黏度的影響情況。

1.4.5.2 明膠起泡性特性的測定

分別配制10、20、30、40 g/L的傳統(tǒng)酸法明膠溶液和凍融法明膠溶液放在50 mL離心管中，用高速均質(zhì)在3 000 r/min速度下攪動1 min，通過泡沫體積占明膠溶液體積的比例表示起泡性。將起泡后的明膠溶液靜置20 min，通過失水率來衡量起泡穩(wěn)定性，失水率越小,起泡穩(wěn)定性越大，計算公式如式(1)、式(2)：

(1)

(2)

式中：V1，明膠溶液的初始體積，mL；V2，高速均質(zhì)后明膠溶液與上層泡沫的總體積，mL；V3，下層析出液體的體積，mL。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠的理化性質(zhì)

明膠成品呈淡黃色片狀，透明度高，如圖1所示。明膠作為膠原蛋白的降解產(chǎn)物，有著很高的蛋白含量，是蛋白質(zhì)的良好來源；明膠中的灰分來源于明膠原料和生產(chǎn)過程中的無機(jī)離子和雜質(zhì)，過高的灰分會影響明膠的膠凍性能；同時明膠中更低的水分含量有利于明膠產(chǎn)品的保存；透射比是衡量其透明度的重要指標(biāo)，透射比越高代表明膠越透明。由表1可以看出,本研究制備的2種明膠粗蛋白含量均高于90%，其灰分、水分含量和透射比等都符合GB 6783—2013《食品添加劑明膠》[15]的要求。2種方法制備的明膠各基本指標(biāo)差異較小，說明2種方法制備的明膠其基本理化性質(zhì)并無二致。

對凍融法明膠和傳統(tǒng)酸法明膠凝膠的顏色進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。凍融法明膠凝膠除a*值外，L*值，和b*值與傳統(tǒng)酸法明膠凝膠沒有顯著差異(P>0.05)，但凍融法明膠凝膠的亮度更低，顏色更偏黃。所以，從顏色角度上來看，凍融法制備的明膠凝膠略微深于傳統(tǒng)酸法明膠，這可能是因?yàn)閮鋈谶^程沒有經(jīng)過長時間酸處理，色素類物質(zhì)溶出量略少。明膠常作為添加劑加入到食品中[16]，但添加量不大，因此它本身的顏色基本不會影響到加工產(chǎn)品的顏色。

a-凍融法明膠；b-傳統(tǒng)酸法明膠圖1 凍融法明膠成品和傳統(tǒng)酸法明膠成品Fig.1 Gelatin prepared by freezing-thawingmethod and traditional acid method

表1 明膠的基本理化性質(zhì)Table 1 The basic physical and chemical properties of gelatin

凍融法明膠傳統(tǒng)酸法明膠GB 6783—2013粗蛋白/%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))92.05±0.87a91.78±1.05a—灰分/%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))0.63±0.08a0.61±0.12a≤2水分/%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))7.21±0.53a6.89±0.43a≤14pH4.54±0.21a4.71±0.11a4.5～6.5透射比/%620 nm56.01±0.53a55.29±0.31a≥30450 nm48.46±0.26a47.32±0.42a≥50

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

表2 凍融法明膠和傳統(tǒng)酸法明膠凝膠的色差結(jié)果Table 2 Chromatic aberration results of freezing-thawing gelatin and traditional acid gelatin gels

注：L*表示亮度；a*為紅綠值；b*為黃藍(lán)值。

2.2 明膠的亞基組成

如圖2所示，豬皮明膠主要由α(α1和α2)帶和β帶組成，其中α帶主要在100～120 kDa，β帶主要在200 kDa左右。電泳圖中凍融法明膠的α組分和β組分含量和傳統(tǒng)酸法明膠觀察不到明顯差別。凍融法明膠在200 kDa以上仍能看到更高分子的條帶，在明膠凝膠化過程中，高分子亞基組分的自組裝和類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成與明膠形成高凝膠強(qiáng)度直接相關(guān)[5]。此外，傳統(tǒng)酸法明膠與凍融法明膠相比，含有更多的低于100 kDa的小分子組分，這可能是因?yàn)殚L時間的酸處理導(dǎo)致更多明膠亞基組分降解所致，明膠中的小分子組分的存在不利于形成高凝膠強(qiáng)度的明膠凝膠[17]。由此可見，凍融法制備的明膠，可以更好地保留明膠的高分子亞基，同時明膠亞基組分降解程度更低，這些賦予明膠更好的凝膠特性。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-凍融法明膠；2-傳統(tǒng)酸法明膠圖2 SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis

2.3 明膠氨基酸組成

表3包含了凍融法和傳統(tǒng)酸法所得明膠的氨基酸組成信息。2種明膠中甘氨酸(Gly)含量最高，分別為268 g/kg和299 g/kg，其次為脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp)，這與膠原原料有重復(fù)的Gly-X-Y序列有關(guān)，X和Y通常分別為脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp)。脯氨酸和羥脯氨酸又叫亞氨基酸，它們能夠與周圍氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)和水分子形成氫鍵，有利于類三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[5]。由表3可以看出，凍融法明膠的亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)含量(252 g/kg)高于傳統(tǒng)酸法明膠(219 g/kg)，使明膠更有可能具有高凝膠強(qiáng)度等好的凝膠特性。

2.4 明膠的質(zhì)構(gòu)分析

全質(zhì)構(gòu)(TPA)可以客觀地反映食品中的力學(xué)性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于許多食品中[18]。表4是2種方法所得明膠的TPA結(jié)果。凍融法明膠的膠著性、黏性、彈力、內(nèi)聚性與傳統(tǒng)酸法明膠相比差異不顯著(P>0.05)，但硬度、黏力、咀嚼性顯著高于傳統(tǒng)酸法明膠(P<0.05)。明膠的硬度直接反映明膠的凝膠強(qiáng)度，凍融法明膠的硬度(368.0 g)顯著高于傳統(tǒng)酸法明膠(341.0 g)(P<0.05)，與SDS-PAGE和氨基酸組成結(jié)果一致，說明凍融法明膠具有更優(yōu)的凝膠特性，這主要與凍融法明膠中含有更多的高分子亞基組分和更少的小分子亞基組分以及跟多的亞氨基酸含量有關(guān)。

2.5 明膠功能特性

2.5.1 明膠流體特性分析

結(jié)果如圖3所示，隨著剪切速率的增加，2種明膠溶液的黏度先迅速下降，而后保持穩(wěn)定，呈現(xiàn)典型假塑性流體特征。隨著剪切速率的增加，凍融法明膠的黏度一直高于傳統(tǒng)酸處理明膠，說明凍融法制備的明膠分子中有更多的鏈狀高分子膠體粒子，這主要是因?yàn)閮鋈诜髂z中高分子組分含量更多，在溶液狀態(tài)下更容易相互纏結(jié)，使體系黏度更高[19]，這一結(jié)果于2種明膠的分子質(zhì)量分布結(jié)果一致。且在剪切速率剛開始變快的階段(0～10 s-1)，凍融法明膠相比與傳統(tǒng)酸法明膠,其剪切變稀的過程更加滯后，由此可見，凍融法明膠對剪切速率的敏感性比傳統(tǒng)酸法明膠對剪切速率的敏感性更小。

表3 凍融法明膠和傳統(tǒng)酸法明膠的氨基酸組成Table 3 The amino acid composition of gelatin prepared by freezing-thawing method and traditional acid method

表4 凍融法明膠和傳統(tǒng)酸法明膠的TPA結(jié)果Table 4 TPA results of freezing-thawing gelatin and traditional acid gelatin

圖3 剪切速率對凍融法明膠和傳統(tǒng)酸法明膠黏度的影響Fig.3 Effect of shear rate on the viscosity of freezing-thawinggelatin and traditional acid gelatin

2.5.2 起泡特性

起泡性是衡量明膠起泡性能的指標(biāo)，其值越高起泡性能越好；泡沫失水率反映泡沫穩(wěn)定性，失水率越小泡沫穩(wěn)定性越高。對凍融法明膠和傳統(tǒng)酸法明膠溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性進(jìn)行評價，結(jié)果如圖4所示，在明膠溶液質(zhì)量濃度從10 g/L增加到30 g/L，凍融法明膠的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均高于傳統(tǒng)酸法明膠，說明凍融法明膠在該濃度范圍內(nèi)具有良好的起泡特性。

A-起泡性；B-失水率圖4 凍融法明膠和傳統(tǒng)酸法明膠起泡性和失水率結(jié)果Fig.4 Results of foaming capacity and water loss offreezing-thawing gelatin and traditional acid gelatin注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

這可能是因?yàn)閮鋈诜髂z中高分子組分更多，溶液狀態(tài)下明膠分子間更易相互纏結(jié)，更易形成氫鍵[20]，有利于界面的穩(wěn)定。但當(dāng)明膠溶液濃度進(jìn)一步增大，2種明膠的起泡性和起泡穩(wěn)定性均下降，這可能是因?yàn)槊髂z濃度過大，明膠中亞基組分由于相互作用等導(dǎo)致疏水基團(tuán)被掩蓋，溶液表面張力增加，難以形成界面，故起泡性能下降。由此可見，凍融法明膠具有良好的發(fā)泡性能，可用于啤酒、棉花糖和化妝品等的制作中。

3 結(jié)論

(1)凍融法明膠和傳統(tǒng)酸法明膠的基本組分均符合國標(biāo)要求，凍融法明膠較傳統(tǒng)酸法明膠含有更多的高分子亞基組分和更低的小分子組分以及更多的亞氨基含量，可賦予凍融法明膠更好的凝膠特性。

(2)相對于傳統(tǒng)酸法明膠，凍融法明膠具有更高的凝膠強(qiáng)度，更好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，且在高剪切速率下具有更高的黏度，這主要是因?yàn)閮鋈诜髂z中高分子組分含量更多，更容易相互纏結(jié)，從而使凍融法明膠加工適應(yīng)性更強(qiáng)。此外，凍融法明膠凝膠顏色略深，但這并不影響其在實(shí)際加工體系中的應(yīng)用。