李佳秀，張春嶺，劉慧，陳大磊，劉杰超，焦中高

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

藍莓，又名藍漿果、越橘，為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）植物，其果實富含糖、有機酸、維生素、氨基酸、微量元素和花青素、酚酸類等生物活性成分，具有改善視力、提高免疫力、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗糖尿病、降血脂、降血壓、保護神經(jīng)細胞等功效，可預(yù)防癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等多種慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展[1-3]，因此深受消費者喜愛。但由于藍莓成熟期正值夏季，且生產(chǎn)時間集中，果實不耐貯運，易造成積壓、腐爛，嚴(yán)重影響市場供應(yīng)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[4-5]。將藍莓加工成果汁、果酒、果醬等產(chǎn)品，不僅可滿足人們美好生活和健康飲食的需要，而且延伸了藍莓產(chǎn)業(yè)鏈條，有助于減少藍莓采后損失，保障藍莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。其中，藍莓果汁由于酸甜適口、營養(yǎng)豐富而深受市場歡迎，成為藍莓加工的主導(dǎo)產(chǎn)品[6-7]。然而，由于藍莓原料價格較高，供應(yīng)受限，使得藍莓果汁極易成為摻假的對象，因此迫切需要建立準(zhǔn)確度高、適用性廣的藍莓果汁摻假鑒定方法，以維護消費者利益和身體健康以及藍莓果汁行業(yè)正常生產(chǎn)秩序，保障藍莓果汁行業(yè)健康發(fā)展。

當(dāng)前用于果汁摻假鑒定的方法主要有感官分析法、特征性成分分析法以及分子生物學(xué)方法等[8-10]。如：Tezcan 等[11]通過比較石榴汁與蘋果汁的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)L-天冬酰胺可以作為鑒別石榴汁中摻假蘋果汁的特征成分；Nuncio-Jáuregui 等[12]通過測定樣品中的脯氨酸、酒石酸、蔗糖含量以及揮發(fā)性成分來鑒定石榴汁中摻入葡萄汁或桃汁；Zhang 等[13]根據(jù)不同果汁中黃酮類、花色苷類等特征性物質(zhì)的差別利用代謝組學(xué)方法可實現(xiàn)對藍莓汁、蔓越莓汁及摻加蘋果汁、葡萄汁的偽品進行鑒別；單核苷酸多態(tài)性實時熒光定量核酸擴增技術(shù)可用于橙汁中摻假柑橘汁的鑒別[14]。這些方法多基于一些特定的摻假行為或產(chǎn)品，識別方式單一，應(yīng)用范圍有限，因此，建立簡單易行、適用性廣泛、結(jié)果可靠的非靶向果汁鑒偽方法顯得尤為迫切。

指紋圖譜技術(shù)是一種從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的非靶向化學(xué)分析方法，具有整體性和模糊性的特點，廣泛應(yīng)用于中草藥及其制劑的質(zhì)量分析與控制[15]。近年來隨著技術(shù)的發(fā)展，指紋圖譜在食品摻假鑒定中也得到了較多的研究和應(yīng)用[16-18]。如：喻鳳香等[19]采用氣相色譜法建立了米糠油的脂肪酸指紋圖譜，通過相似度分析可實現(xiàn)摻偽量16%以上的米糠油的定量判斷；胡明華等[20]利用硫酸水解及柱前衍生化高效液相色譜法分析得到可可粉多糖組分的指紋圖譜，結(jié)合系統(tǒng)聚類分析可實現(xiàn)摻加15%及以上可可殼的可可粉的鑒別；Tian 等[21]采用氣相色譜-質(zhì)譜方法建立了小白杏杏仁油的脂肪酸指紋圖譜，并成功應(yīng)用于摻假鑒定；孫亞娟等[22]采用頂空固相微萃取和氣相色譜技術(shù)建立杏仁油揮發(fā)性成分指紋圖譜，可用于菜籽油摻偽量15%以上杏仁油的鑒別；李寶麗等[23]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立預(yù)包裝純葡萄汁的香氣成分的氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析能準(zhǔn)確將預(yù)包裝混合果汁、葡萄汁飲料和純葡萄汁鑒別區(qū)分；楚剛輝等[24]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜結(jié)合主成分分析和聚類分析對喀什樹莓果汁與市售其他果汁進行區(qū)分。但應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)鑒別果汁的摻假還很少見。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同種類果汁的有機酸組成存在著較大差異，可以根據(jù)果汁中主要有機酸的組成特征來鑒別果汁類型和控制果汁質(zhì)量[25]。本研究在此基礎(chǔ)上，采用HPLC 法對不同產(chǎn)地、不同品種的10 個藍莓果汁的有機酸組成進行分析，構(gòu)建藍莓果汁有機酸的HPLC 指紋圖譜，并通過相似度評價、主成分分析和聚類分析，對模擬在藍莓果汁中添加低價果汁（梨汁、蘋果汁、杏汁和桃汁）和外源檸檬酸等摻假方式進行鑒別，以期為藍莓果汁的摻假鑒定和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓果實分別采自江蘇連云港和山東臨沂，各5個品種，采收后立即運抵實驗室，剔除病蟲害果、腐爛果，選取大小、著色基本一致的果實供制汁用。供試藍莓品種、產(chǎn)地及果汁樣品編號見表1。

表1 供試藍莓果汁樣品及編號Table 1 Samples and numbers of tested blueberry juices

草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國sigma 公司；磷酸（分析純）：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二銨（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1525 高效液相色譜儀（配有2707 自動進樣器，2998 二極管陣列檢測器）：美國Waters 公司；JYLC52V 九陽料理機：九陽股份有限公司；1000 mL 砂芯過濾裝置：津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓果汁制備工藝

藍莓果實→打漿→滅酶（沸水浴，5 min）→冷卻→加果膠酶酶解（0.1%，50 ℃，40 min）→冷卻→離心→過濾→藍莓果汁

制得的藍莓果汁貯存于-80 ℃超低溫冰箱，分析前取出2 mL 加水定容至10 mL，用0.22 μm 微孔濾膜過濾。

1.3.2 果汁摻假樣品

摻加低價果汁：藍莓汁中分別摻加20 %、40 %、60%、80%、100%的梨汁、蘋果汁、桃汁和杏汁作為偽品，若摻加量為20%時用相似度評價仍能鑒別出偽品，將摻加量降至10%。

摻加外源酸：在原果汁含量為20%的藍莓汁中摻假檸檬酸作為偽品，檸檬酸摻加量為果汁總重量的0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%共 5 個梯度，供試摻假樣品及編號見表2。

表2 供試摻假樣品及編號Table 2 Numbers of tested adulterate samples

1.3.3 色譜條件

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 精密度試驗

取同一藍莓果汁樣品，按1.3.3 色譜條件連續(xù)測定5 次，計算各共有峰保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.2 穩(wěn)定性試驗

取同一藍莓果汁樣品，按1.3.3 色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 測定，計算各共有峰的保留時間和峰面積的RSD。

1.3.4.3 重復(fù)性試驗

取同一藍莓果汁樣品，平行制備5 份供試樣品溶液，按1.3.3 色譜條件分別進樣測定，計算各共有峰保留時間和峰面積的RSD。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 處理試驗數(shù)據(jù)，將HPLC 圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（V2.0）”軟件，構(gòu)建對照指紋圖譜，并采用夾角余弦法進行相似度評價。

用SAS9.3 統(tǒng)計分析軟件進行聚類分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

采用1.3.3 所述色譜條件，藍莓果汁樣品連續(xù)測定5 次，各共有峰保留時間和峰面積的RSD 分別小于0.36%和2.84%，說明該方法具有較高的精密度。同一樣品在24 h 內(nèi)的6 次測定結(jié)果中，各共有峰保留時間和峰面積的RSD 分別為0.08 %～2.00 %和1.66 %～2.41%，說明該方法在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。同時，重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，各共有峰保留時間和峰面積的RSD分別為0.05%～0.48%和2.71%～3.07%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.2 指紋圖譜共有模式的建立及相似度評價

2.2.1 樣品圖譜的采集

所有藍莓果汁樣品按1.3.3 色譜條件分別進樣分析，得到不同藍莓果汁樣品的HPLC 圖譜，見圖1。

圖1 藍莓汁HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of blueberry juices

2.2.2 指紋圖譜共有模式的建立及共有峰的標(biāo)定

將10 個藍莓果汁樣品的HPLC 圖譜數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（V2.0）”，通過設(shè)置參照圖譜、多點校正、色譜峰匹配、生成對照4 個步驟，得到10 個藍莓果汁指紋圖譜的共有模式（即對照指紋圖譜）。圖1 中R 為生成的對照指紋圖譜，共標(biāo)定了13 個共有峰。在1.3.3 色譜條件下，將草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸及其混合標(biāo)準(zhǔn)品依次進樣，根據(jù)保留時間將標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖與樣品色譜圖進行對比，共指認(rèn)出了5 個共有峰，其中3 號峰為奎寧酸、4 號峰為蘋果酸、5 號峰為莽草酸、7 號峰為檸檬酸、8 號峰為富馬酸。

2.2.3 共有峰的相對保留時間和相對峰面積

參照峰的確定是建立指紋圖譜的關(guān)鍵，通常選取分離度較好、峰位居中、峰面積較大且穩(wěn)定的色譜峰為參照峰[23，26]。通過比較10 個藍莓果汁的色譜圖，發(fā)現(xiàn)7 號峰（檸檬酸）分離度好、比較穩(wěn)定，峰面積也較大，因此選取7 號峰作為參照峰，其保留時間和峰面積計為“1”，計算其余共有峰的相對保留時間的平均值和相對峰面積值，結(jié)果見表3。

從表3 可以看出，10 個藍莓果汁樣品的共有峰的相對峰面積差別較大，13 個共有峰的RSD 在18.99%～64.97%之間，這說明10 個藍莓果汁的主要特征成分含量差別較大，不同品種、不同產(chǎn)地的藍莓果汁的指紋圖譜存在一定的差異。

表3 10 個樣品13 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積Table 3 Relative retention time and relative peak area of 13 common peaks for 10 samples

2.2.4 相似度評價

運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（V2.0）”對10 個藍莓果汁樣品色譜圖及對照指紋圖譜R 進行相似度評價，結(jié)果見表4。

從相似度評價結(jié)果可以看出，所有藍莓果汁之間的相似度均在0.950 以上，10 個樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均在0.978 以上。說明不同品種、不同產(chǎn)地藍莓果汁的有機酸HPLC 指紋圖譜具有較好的一致性，本研究建立的藍莓汁對照指紋圖譜和標(biāo)定的13 個共有峰可以反映藍莓果汁的有機酸指紋特征，具有鑒定評價意義。

表4 藍莓果汁樣品與對照指紋圖譜的相似度Table 4 Similarities between fingerprint of blueberry juice samples and reference

在指紋圖譜應(yīng)用于真?zhèn)舞b定的評價中，通常采用不同樣品與對照指紋圖譜相似度的平均值或最小值作為閾值[27-28]。在本研究中，10 個不同藍莓果汁樣品與對照指紋圖譜的相似度均在0.978 以上，因此可初步確定0.978 為藍莓果汁的相似度閾值，相似度低于0.978 則可能是摻假藍莓果汁。

2.3 摻假樣品的鑒別

藍莓果汁按1.3.2 摻假方法處理后，按1.3.3 色譜條件進樣分析，得到27 種摻假樣品的色譜圖。應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（V2.0）”軟件將摻假樣品的指紋圖譜與藍莓果汁對照指紋圖譜進行相似度分析，結(jié)果見表5。

由表5 可以看出，隨著低價果汁和檸檬酸摻加量的增加，摻假樣品的指紋圖譜與藍莓果汁對照指紋圖譜的相似度逐漸降低。當(dāng)梨汁與蘋果汁的摻加量達到40%，杏汁和桃汁的摻加量達到20%時，摻假樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度低于藍莓果汁的相似度閾值0.978，此時摻假樣品與藍莓果汁可以區(qū)分開。同時由表5 還可以看出，當(dāng)檸檬酸的摻加量≥0.15%時，摻假果汁樣品與對照指紋圖譜的相似度即低于藍莓果汁的相似度閾值0.978，從而可以鑒別出來。

表5 摻假樣品與藍莓果汁對照指紋圖譜的相似度Table 5 Similarities between fingerprint of adulterate samples and reference

2.4 化學(xué)計量學(xué)分析

2.4.1 主成分分析

以10 個藍莓樣品和27 種摻假樣品為研究對象，以每個樣品的指紋圖譜中各色譜峰面積組成原始數(shù)據(jù)矩陣，用SAS9.3 統(tǒng)計分析軟件進行主成分分析，結(jié)果見表6 和圖2。

表6 主成分的特征值及其貢獻率Table 6 Eigenvalues，proportion and cumulative proportion of principal components

續(xù)表6 主成分的特征值及其貢獻率Continue table 6 Eigenvalues，proportion and cumulative proportion of principal components

圖2 主成分分析的得分圖Fig.2 Score plots obtained from the principal component analysis

由表6 可以看出，根據(jù)特征值大于1 提取主成分，共提取了4 個主成分。4 個主成分的累計方差貢獻率為87.70%，基本可以反映全部色譜峰數(shù)據(jù)所具有的信息。從主成分1 和主成分2 的得分圖（圖2a）中可以看出，所有藍莓汁都分布在第一主成分的負方向和第二主成分的正方向，摻假梨汁、蘋果汁、杏汁、桃汁的偽品隨著摻加量的增加，在得分圖中的分布也越來越遠，從而可實現(xiàn)區(qū)分和鑒別。除了摻加20%蘋果汁（PW1）、40%蘋果汁（PW2）、10%桃汁（TW0）的藍莓汁偽品外，其余摻加低價果汁的偽品都能與藍莓汁樣品明顯區(qū)分開來。而在主成分1 和主成分3 的得分圖（圖2b）中，摻假梨汁和桃汁的所有偽品都可明顯區(qū)分開來。此外，所有摻加檸檬酸的偽品都能與藍莓汁完全區(qū)分，說明通過主成分分析可以準(zhǔn)確地識別摻加檸檬酸的藍莓果汁。

2.4.2 聚類分析

對10 個藍莓汁樣品和27 種偽品的原始色譜圖提取色譜峰數(shù)據(jù)，獲得一個矩陣，運用SAS9.3 統(tǒng)計分析軟件進行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 藍莓汁及偽品的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram of blueberry juices and adulterate samples

由圖3 可以看出，當(dāng)歐氏距離為0.8 時，所有研究對象可以聚為兩類，摻加檸檬酸的5 種偽品單獨聚為一類，其余偽品與所有藍莓汁樣品聚為一類；當(dāng)歐式距離為0.4 時，所有研究對象可以聚為6 類，摻加檸檬酸的5 種偽品單獨聚為一類，摻加杏汁的4 個偽品（XW2、XW3、XW4、XW5）聚為一類，藍莓汁樣品 LM10單獨聚為一類，摻加梨汁的5 個偽品（LW1、LW2、LW3、LW4、LW5） 聚為一類，5 個藍莓汁樣品 LM2、LM3、LM4、LM5、LM9 聚為一類，其余藍莓汁樣品與偽品聚為一類；當(dāng)歐式距離為0.35 時，所有藍莓汁樣品都可以與27 種摻假樣品全部區(qū)分開。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)藍莓果汁有機酸的高效液相色譜分析方法，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（V2.0）”軟件，建立了藍莓果汁HPLC 指紋圖譜。相似度評價結(jié)果表明，10 個藍莓果汁的有機酸HPLC 指紋圖譜間相似度均在0.950 以上，與對照指紋圖譜的相似度均在0.978 以上，不同品種、不同產(chǎn)地的藍莓果汁的指紋圖譜具有很好的一致性。藍莓果汁中添加其他果汁或檸檬酸可導(dǎo)致相似度降低，而且摻假量越大，其指紋圖譜與對照指紋圖譜之間的差異越大，但摻假量較小的樣品僅用相似度評價不能從藍莓果汁中分辨出來。應(yīng)用藍莓果汁有機酸的高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合主成分分析和聚類分析等模式識別方法，可以實現(xiàn)對藍莓果汁與摻假低價果汁（梨汁、蘋果汁、杏汁和桃汁）和外源檸檬酸樣品的區(qū)分，而且摻假量越大，區(qū)分效果越好。因此，有機酸HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析，可用于藍莓果汁摻假鑒定和質(zhì)量控制。