吳月國，趙錚蓉，吳蓓麗，張萍，梁世寶，劉驊，*

（1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州310013；2.溫州市中心醫(yī)院，浙江溫州325000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是傳統(tǒng)名貴中藥材，具有降糖、降脂、抗炎、護(hù)肝等作用[1-4]。靈芝為多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma Lucidum Karst.）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子實體，亦是傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補氣安神、止咳平喘、抗癌、降壓等功效[5-7]。保健酒是將中藥與酒“溶”于一體的藥酒，不僅配制方便、藥性穩(wěn)定、安全有效，而且因為酒精是一種良好的半極性有機(jī)溶劑，藥借酒力、酒助藥勢而充分發(fā)揮其效力，提高療效。鐵皮石斛靈芝酒是以鐵皮石斛與靈芝為主要原料，依據(jù)中醫(yī)養(yǎng)生理論組方，經(jīng)配方、工藝篩選后精制而成的保健酒。本研究采用提取、浸泡、配制等工藝制備鐵皮石斛靈芝酒，考察其對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，以期進(jìn)一步的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：浙江民康天然植物制品有限公司；靈芝、黃精、枸杞：華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司；白酒：建德市嚴(yán)東關(guān)酒廠；ICR 小鼠：浙江省實驗動物中心。

無水葡萄糖：中國食品藥品檢定研究院；苯酚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸：西隴化工股份有限公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；印度墨汁：南京都萊生物技術(shù)有限公司；刀豆蛋白ConA：美國sigma 公司；噻唑藍(lán)、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；0.22 μm孔徑濾膜：密理博中國有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基：美國gibco 公司；YAC-1 細(xì)胞：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；紅細(xì)胞裂解液：浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所自配（配方：NH4Cl 0.3735 g，Tris 0.13 g，溶于 50 mL 雙蒸水，0.22 μm 過濾除菌后使用）。

1.2 儀器

T6 新世紀(jì)分光光度計：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；AG285 型電子天平、XS205 型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DM5500BLED 型熒光顯微鏡：德國萊卡公司；THERMO 3111 培養(yǎng)箱：美國賽默飛世爾科技公司；BIORAD 680 酶標(biāo)儀：美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛靈芝酒制備和含量測定

鐵皮石斛靈芝酒是以鐵皮石斛、靈芝為主要原料，復(fù)配黃精和枸杞子，經(jīng)提取、浸泡、配制等主要工序精制而成[8-9]，人體推薦劑量為每人每日100 mL。苯酚-濃硫酸法測定粗多糖含量[10]。

1.3.2 鐵皮石斛靈芝酒免疫活性測定

1.3.2.1 小鼠分組與給藥

ICR 小鼠，清潔級，雄性，體重 17 g～21 g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2016-0010。實驗動物飼料由協(xié)同醫(yī)藥生物工程公司提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB 14924.3《2010 實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》。飲用水為滅菌城市飲用水，符合GB 5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。挑選健康ICR 小鼠，按照運動能力，體重狀況分成4 組：陰性對照組、鐵皮石斛靈芝酒低、中、高劑量組，每組10 只。實驗前先將鐵皮石斛靈芝酒濃縮20 倍，然后按人體推薦量的5、10、30 倍劑量配置成低劑量、中劑量、高劑量（8.33、16.67、50.00 mL/kg）的酒精度為 15°的供試品；陰性對照組為15°白酒。供試品灌胃體積為20 mL/kg，每天一次，連續(xù)30 d[11-13]。

1.3.2.2 免疫器官重量與臟器系數(shù)測定

灌胃給藥30 d，小鼠斷頸處死，75%酒精消毒，無菌解剖，取胸腺，脾臟，肝臟，除去殘留在臟器上的血液，秤重。最后用所得數(shù)據(jù)計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)（g/10 g）=器官質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3.2.3 二硝基氯苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹實驗

第24 天灌胃給藥后1 h，將1%二硝基氯苯丙酮橄欖油（丙酮：橄欖油體積比1 ∶1）涂抹在小鼠腹部，涂抹劑量為每只100 uL。給藥第25 天，重復(fù)以上步驟。給藥第29 天，各組小鼠右耳前后面均勻涂抹1%二硝基氯苯丙酮橄欖油，涂抹劑量為每只100 μL。各組小鼠左耳以同等方式涂抹橄欖油混合液作為對照。1 d 后，處死小鼠，剪下兩邊耳殼。剪取部位應(yīng)在同一部位。取下耳片形狀均為橢圓形。小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)由左右耳重量差表示。

1.3.2.4 碳粒廓清實驗

灌胃給藥30 d，將印度墨汁用生理鹽水稀釋5 倍。注射入小鼠體內(nèi)小鼠軀干發(fā)黑（0.1 mL/10 g）。在注射后 2、10 min 從眼眶靜脈叢取血 20 μL，加入到 2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，600 nm 波長測定OD 值，并將小鼠處死，取肝臟、脾臟，稱重。整理得吞噬指數(shù)。

1.3.2.5 脾淋巴細(xì)胞體外增殖作用實驗

取1.3.2.2 所得小鼠脾臟，裝于含磷酸緩沖鹽溶液的培養(yǎng)皿中，以5 mL 注射塞碾磨，混勻，200 目滅菌雙層尼龍篩過濾。合并濾液，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，彈勻后加少量破紅裂解液，以磷酸緩沖鹽溶液中和破紅，1 500 r/min 再次離心5 min，棄上清，以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液輕輕吹打重懸沉淀。調(diào)整小鼠脾細(xì)胞為 1.5×109個/mL，100 μL/孔種板于 96孔中。設(shè)對照組，鐵皮石斛靈芝酒低、中、高劑量組；各組又分單獨處理組和聯(lián)合ConA（5 μg/mL）組；每孔加入供試品100 uL，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，每孔加入噻唑藍(lán)（5 mg/mL）20 μL 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。以移液槍小心吸去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，37 ℃孵育20 min，490 nm 測定OD 值。計算增殖指數(shù)：增殖指數(shù)=（OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）

1.3.2.6 小鼠NK 細(xì)胞的活性測定

靶細(xì)胞的傳代（YAC-1 細(xì)胞）：實驗前24 h 將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以磷酸緩沖鹽溶液洗3 次，用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL。

小鼠脾細(xì)胞懸液的制備（效應(yīng)細(xì)胞）：方法同1.3.2.5。

NK 細(xì)胞活性檢測：取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各50 μL（效靶比 50 ∶1），加入 U 型 96 孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各50 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%聚乙二醇辛基苯基醚各50 μL。

設(shè)對照組，鐵皮石斛靈芝酒低、中、高劑量組；各組又分單獨處理組和聯(lián)合ConA 組；每孔加入供試品100 μL，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，然后將96 孔培養(yǎng)板以1 500 r/min 離心5 min，每孔吸取上清120 μL 置平底96 孔培養(yǎng)板中，同時加入乳酸脫氫酶檢測工作液 60 μL，混勻，室溫（約 25 ℃）避光孵育30 min（用鋁箔包裹后置于水平搖床上緩慢搖動）。然后在490 nm 處測定吸光度。計算NK 細(xì)胞活性：

NK 細(xì)胞活性/%=（反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD）/（最大釋放孔OD-自然釋放孔OD）

1.4 數(shù)據(jù)分析

各組數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛靈芝酒含量測定

粗多糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.056 0x-0.006 4，r=0.999 8，每100 mL 鐵皮石斛靈芝酒中粗多糖（以無水葡萄糖計）含量約為160 mg。

2.2 免疫器官重量及臟器系數(shù)測定結(jié)果

免疫器官重量及臟器系數(shù)測定結(jié)果見表1。

表1 小鼠臟器指數(shù)表（）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（）

表1 小鼠臟器指數(shù)表（）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（）

注：與陰性對照組比較，**表示差異極顯著，P＜0.01。

肝臟/體重比值/（g/10 g）陰性對照組 0 0.044±0.004 0.015±0.002 0.556±0.026低劑量組 8.33 0.048±0.004 0.048±0.004** 0.539±0.037中劑量組 16.67 0.046±0.005 0.046±0.005** 0.520±0.016**高劑量組 50.00 0.045±0.003 0.014±0.002 0.533±0.028組別 劑量/（mL/kg）脾臟/體重比值/（g/10 g）胸腺/體重比值/（g/10 g）

與陰性對照組比較，鐵皮石斛靈芝酒各劑量組小鼠脾臟/體重比值均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；低、中劑量組的胸腺/體重比值有顯著差異（P＜0.01）；鐵皮石斛靈芝酒各劑量組小鼠肝臟/體重比值均明顯下降，其中中劑量組有顯著差異（P＜0.01）。

2.3 二硝基氯苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹實驗結(jié)果

小鼠耳腫脹實驗結(jié)果見表2。

與陰性對照組比較，在引發(fā)超敏反應(yīng)后，鐵皮石斛靈芝酒高劑量組小鼠右耳腫脹明顯。中、低劑量組腫脹度有下降趨勢，尤其中劑量組腫脹度下降趨勢明顯，但也不具統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 小鼠耳腫脹實驗結(jié)果（）Table 2 Effect of the ear swelling experiment on mice（）

表2 小鼠耳腫脹實驗結(jié)果（）Table 2 Effect of the ear swelling experiment on mice（）

組別劑量/（mL/kg）腫脹度/mg陰性對照組 0 3.83±2.83低劑量組 8.33 3.60±1.80中劑量組 16.67 1.99±1.24高劑量組 50.00 5.09±2.66

2.4 碳粒廓清實驗結(jié)果

碳粒廓清實驗結(jié)果見表3。

表3 碳粒廓清實驗結(jié)果（）Table 3 Effect of the carbon clearance index（）

表3 碳粒廓清實驗結(jié)果（）Table 3 Effect of the carbon clearance index（）

注：與陰性對照組比較，*表示差異顯著，P＜0.05。

組別劑量/（mL/kg）吞噬指數(shù)陰性對照組 0 3.78±1.181低劑量組 8.33 4.46±0.80中劑量組 16.67 4.81±0.56*高劑量組 50.00 4.34±1.16

與陰性對照組相比，鐵皮石斛靈芝酒各劑量組小鼠的吞噬指數(shù)均增加，中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明鐵皮石斛靈芝酒能提高小鼠碳廓清能力，單核-巨噬細(xì)胞功能實驗結(jié)果陽性。

2.5 脾淋巴細(xì)胞體外增殖作用的影響試驗結(jié)果

脾淋巴細(xì)胞增殖能力的測定結(jié)果見表4。

表4 脾淋巴細(xì)胞增殖能力的測定結(jié)果（）Table 4 Effect of the transformation level of lymphoid on mice（）

表4 脾淋巴細(xì)胞增殖能力的測定結(jié)果（）Table 4 Effect of the transformation level of lymphoid on mice（）

注：各給藥組與正常細(xì)胞組比較，**表示差異極顯著，P＜0.01。ConA處理組與正常細(xì)胞組比較，#表示差異顯著，P＜0.05，##表示差異極顯著，P＜0.01。

增殖指數(shù)（聯(lián)合ConA 處理）陰性對照組 0 1±0.03 2.17±0.42#低劑量組 8.33 1.12±0.21 1.17±0.12中劑量組 16.67 7.4±0.15** 5.37±1.78高劑量組 50.00 10.39±0.64** 11.77±0.17##組別劑量/（mL/kg） 增殖指數(shù)（單獨處理）

如表4 所示，單獨給藥時，鐵皮石斛靈芝酒具有明顯的促淋巴細(xì)胞增殖作用，并且這一作用呈濃度依賴性增加。ConA 聯(lián)合處理組對小鼠淋巴細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用，高劑量組與對照組相比有顯著性差異。聯(lián)合給藥時，鐵皮石斛靈芝酒各劑量組刺激脾淋巴細(xì)胞增殖程度均較單獨給藥時沒有顯著性差異，提示其與ConA 沒有協(xié)同促進(jìn)作用。

2.6 NK細(xì)胞活性測定結(jié)果

NK 細(xì)胞活性測定結(jié)果見表5。

表5 NK 細(xì)胞活性測定結(jié)果（）Table 5 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（）

表5 NK 細(xì)胞活性測定結(jié)果（）Table 5 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（）

注：聯(lián)合ConA 處理組與正常細(xì)胞組比較，*表示差異顯著，P＜0.05。

NK 細(xì)胞活性/%（聯(lián)合ConA 處理）陰性對照組 0 -6.48±6.24 -25.50±18.85低劑量組 8.33 13.06±28.89 64.37±19.64*中劑量組 16.67 -3.55±6.30 -3.13±0.73高劑量組 50.00 -4.08±2.02 -5.02±1.27組別劑量/（mL/kg） NK 細(xì)胞活性/%（單獨處理）

在對NK 細(xì)胞活性測定試驗中，與陰性對照組相比，鐵皮石斛靈芝酒單獨處理組及聯(lián)合給藥高、中劑量組對小鼠NK 細(xì)胞活性無顯著影響，鐵皮石斛靈芝酒單獨處理及聯(lián)合給藥低劑量組有增加NK 細(xì)胞活性趨勢，且聯(lián)合給藥低劑量組與對照組存在顯著性差異。

3 結(jié)論

依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)養(yǎng)生理論配伍的鐵皮石斛靈芝酒中，主料鐵皮石斛滋陰補虛，益脾肺腎，護(hù)肝膽，填五臟內(nèi)虛不足；配伍靈芝，滋肝健脾，養(yǎng)血安神；黃精，枸杞子，滋腎陰補脾氣益精血，以助滋陰培本之力；白酒辛溫走散，引藥入血；諸品合用共奏滋陰精益肝脾，以達(dá)培本清源之功。本研究中，將鐵皮石斛、靈芝、黃精、枸杞子添加到白酒浸提，制成鐵皮石斛靈芝酒，采用現(xiàn)代藥效學(xué)的研究方法，評價其對小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性，結(jié)果顯示鐵皮石斛靈芝酒能提高小鼠胸腺指數(shù)，降低小鼠耳腫脹度，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增加小鼠吞噬指數(shù)和NK 細(xì)胞活性。表明鐵皮石斛靈芝酒各組分組成的一個整體，產(chǎn)生了協(xié)同作用，具有增強免疫力的保健功能，可用于開發(fā)增強免疫力作用的保健食品或藥物。