汪瑞敏，趙衛(wèi)紅，孫大利，李博巖，張清海，周艷，徐良

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；3.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南?？?70100；4.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省食品質(zhì)量與安全科技服務(wù)平臺，貴州貴陽550025；5.貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，貴州貴陽550025；6.貴州民族大學(xué)人文科技學(xué)院，貴州貴陽550025）

黃秋葵，又名黃葵、羊豆角、補(bǔ)腎菜，屬錦葵科、秋葵屬，是一種分布在亞熱帶以及熱帶的草本植物[1-2]。黃秋葵的嫩果中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維、礦物質(zhì)、黃酮及多糖等成分。黃秋葵具有疏通腸道、開胃的功能，長時間食用黃秋葵可以助消化、調(diào)和脾胃，對胃炎、肝臟等疾病都有一定的療效。黃秋葵水提液中含有果膠和黏性蛋白糖高分子為主要成分的聚合體[3-6]，可被用作天然食品增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑[7-9]。黃秋葵的水提液在生物活性功效方面被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)腸胃蠕動、預(yù)防便秘、增強(qiáng)人體的耐力，補(bǔ)充能量。同時，黃秋葵中的膳食纖維可以促進(jìn)體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行排泄。適量食用可以降低人體的血清膽固醇，減少體內(nèi)毒素的積累，可以有效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[10-11]。

乳酸菌是一類對人體十分有益的菌群，其在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、醇類及各種氨基酸等代謝物，具有抑制腐敗菌、提高消化率等生理功效。乳酸菌發(fā)酵食品中的營養(yǎng)成分較高，乳酸菌進(jìn)入人體以后，能將腸道中的細(xì)菌和雜質(zhì)分解，產(chǎn)生乳酸和抗菌物質(zhì)，促進(jìn)腸道菌群平衡[12]。從醫(yī)學(xué)的角度來看乳酸菌可以促進(jìn)體內(nèi)雜質(zhì)和致癌物質(zhì)的分解[13]。乳酸菌不僅能夠清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基[14]，并且乳酸菌發(fā)酵以后可以增強(qiáng)發(fā)酵液清除自由基的能力，有研究報道乳酸菌發(fā)酵能夠顯著提高櫻桃[15]、卷心菜[16]等發(fā)酵液中總酚含量及其抗氧化活性，并且選擇不同的乳酸菌菌種發(fā)酵，對桂圓肉中酚類物質(zhì)釋放及抗氧化能力有顯著差異[17]。也有研究報道乳酸菌發(fā)酵的果蔬酸奶可以明顯提高強(qiáng)酸奶的抗氧化活性，可改善其風(fēng)味及口感[18]。

酸奶是以鮮奶作為原料，經(jīng)過巴氏殺菌后并添加純?nèi)樗峋N，再經(jīng)過發(fā)酵、冷卻灌裝制成的奶制品。酸奶比鮮奶及各種奶粉營養(yǎng)價值更高。發(fā)酵過程某些菌種使奶中20%的乳糖、蛋白質(zhì)被水解成為小分子，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。鮮奶中的脂肪含量在3%～5%之間。經(jīng)發(fā)酵后，乳制品中的脂肪酸能達(dá)到原料奶中的2 倍，使酸奶比鮮奶更容易被人體消化和吸收[19-21]。特別是對患有乳糖消化不良的人來說，喝酸奶不會導(dǎo)致腹脹腹瀉。酸奶中還含有豐富的活性乳酸菌和短鏈脂肪酸，可以促進(jìn)腸道蠕動，治療便秘。發(fā)酵后牛奶中的鈣和其他礦物質(zhì)都沒有發(fā)生改變，但牛奶發(fā)酵后產(chǎn)生的乳酸能夠有效地提高鈣、磷在人體內(nèi)的利用率，所以人體更容易吸收酸奶之中的鈣磷。

本文選擇單一菌種（保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌其一）作為發(fā)酵劑，探究不同發(fā)酵劑、不同黃秋葵汁添加量等因素，對黃秋葵酸奶的品質(zhì)及抗氧化活性的影響，以期望在豐富黃秋葵的加工利用以外，為黃秋葵酸奶在不同乳酸菌發(fā)酵后增強(qiáng)了其清除自由基能力提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌）、黃秋葵：市售；碳酸鈉、無水乙醇、磷酸、硫酸亞鐵、雙氧水、沒食子酸、甲醇、氯化鋁、乙酸鉀：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；DPPH（98%）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鄰菲羅啉（99%）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

智能生化培養(yǎng)箱（SHP-160）：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；破壁機(jī)（JYL-Y912）：九陽股份有限公司；冷凍離心機(jī)（TGL20M）：長沙邁佳儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計（T6）：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃秋葵汁制備

黃秋葵去蒂清洗，并放入沸水中熱燙2 min 后晾干。用破壁機(jī)將黃秋葵與蒸餾水按質(zhì)量比1 ∶3 進(jìn)行榨汁，之后過濾（60 目），獲得黃秋葵汁液置于冰箱備用。

1.3.2 工藝流程

原料混合（黃秋葵汁、白糖、純牛奶）→均質(zhì)→滅菌→冷卻→接種→灌裝→封口→保溫發(fā)酵→冷藏后熟→成品

1.3.3 單因素試驗

1）白砂糖添加量的選擇

以50 g 純牛奶為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵溫度為42 ℃，發(fā)酵時間4 h，黃秋葵汁添加量8%，保加利亞乳桿菌接種量3%，分別添加（5%、6%、7%、8%）的白砂糖，研究不同白砂糖添加量對黃秋葵酸奶品質(zhì)的影響。

2）黃秋葵汁添加量的選擇

以50 g 純牛奶為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵溫度為42 ℃，發(fā)酵時間4 h，白砂糖添加量6 %，保加利亞乳桿菌接種量3 %，分別添加（5%、6%、7%、8%）的黃秋葵汁，研究不同黃秋葵汁添加量對與黃秋葵酸奶品質(zhì)的影響。

3）發(fā)酵時間的選擇

以50 g 純牛奶為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵溫度為42 ℃，白砂糖添加量6%，黃秋葵汁添加量8%，保加利亞乳桿菌接種量 3%，分別發(fā)酵（3、4、5、6 h），研究不同發(fā)酵時間對與黃秋葵酸奶品質(zhì)的影響。

1.3.4 正交試驗

為了進(jìn)一步優(yōu)化黃秋葵酸奶的工藝，以黃秋葵汁添加量，白砂糖添加量，發(fā)酵時間，乳酸菌種類作為試驗因素，在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計四因素三水平正交試驗，以抗氧化能力及感官評分標(biāo)準(zhǔn)為指標(biāo)對酸奶的功能性、組織狀態(tài)，風(fēng)味，口感進(jìn)行評分。正交因素水平表如表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 感官評分

以10 名具備食品專業(yè)及酸奶感官評價背景的學(xué)生對酸奶成品進(jìn)行感官評分。分?jǐn)?shù)統(tǒng)計取各分?jǐn)?shù)的平均值，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory score sheet of okra yogurt

1.3.6 體外抗氧化試驗

1）DPPH 自由基清除能力

取8 mL 0.1 mmoL/L DPPH 乙醇溶液與2 mL 酸奶樣品溶液或95%乙醇（空白對照）混合，充分振蕩后室溫（25 ℃）下暗處反應(yīng)30 min。接著混合樣品在以4 ℃，5 000 r/min 離心 10 min 后，于 515 nm 處測定上清液的吸光度值[22]。DPPH·清除率（%）按照式（1）計算：

式中：A0為空白吸光值；A1為樣品吸光值。

2）羥基自由基（·OH）的清除能力

5×10-3mol/L 鄰菲啰啉溶液 1.5 mL 與 2.0 mL、0.05 mol/L、pH 7.4 磷酸緩沖液混合均勻后，加入1.0 mL、7.5×10-3mol/L FeSO4溶液，混勻后再加入 1 mL、0.1%H2O2，以蒸餾水定容至 10 mL，37 ℃溫育 1 h 后，在536 nm 下測A2。依據(jù)上述方法，分別測定不同酸奶樣品的 A1；不加 H2O2樣品溶液的為 A0。·OH 清除率（%）按照式（2）計算[23]：

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0 軟件分析試驗數(shù)據(jù)，平均值的差異性用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）中的最小顯著差異法（least significant difference，LSD）檢驗，P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)差異。所有試驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對酸奶品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間對酸奶中的酸度形成十分重要，因此在單因素試驗中，對發(fā)酵時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對酸奶品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on yogurt quality

由圖1 可知，酸奶的品質(zhì)隨著發(fā)酵時間的延長，感官評分呈上升，當(dāng)發(fā)酵時間為5 h 時感官評分達(dá)到最高，此時的酸奶組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定、口感良好，酸奶的品質(zhì)最佳。繼續(xù)發(fā)酵到下去到6 h 時，感官評分下降，酸奶的酸度增加，酸甜比失調(diào)。酸奶口感變差，酸奶品質(zhì)不佳。

2.1.2 白砂糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響

白砂糖可以調(diào)和由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的尖酸味，對酸奶的口感十分重要，白砂糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 白砂糖添加量對酸奶品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of sugar addition on yogurt quality

由圖2 可知，酸奶的品質(zhì)隨著白砂糖的添加量的增加感官評分上升，當(dāng)白砂糖添加量達(dá)到到6%時感官評分達(dá)到最高，酸奶的組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定、口感良好，酸奶的品質(zhì)達(dá)到最佳。當(dāng)白砂糖添加量繼續(xù)增加到8%后。酸奶的感官評分降低，酸奶口感變膩。酸奶中白砂糖添加量過低時導(dǎo)致酸奶酸味較重，如果白砂糖添加量繼續(xù)增加就會使酸奶口感變差，有甜膩的感覺。

2.1.3 黃秋葵添加量對酸奶品質(zhì)的影響

黃秋葵汁液添加量會影響酸奶的口感、風(fēng)味、色澤，因此需要單因素試驗進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖3。

圖3 黃秋葵添加量對酸奶品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of the addition of yellow okra on the quality of yogurt

由圖3 可知，開始酸奶的品質(zhì)隨著黃秋葵汁添加量的增加感官評分上升，當(dāng)黃秋葵汁添加量達(dá)到6%時感官評分達(dá)到最高。酸奶的組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定、口感良好，酸奶的品質(zhì)達(dá)到最佳。繼續(xù)增加黃秋葵汁添加量后感官評分降低，酸奶中黃秋葵的氣味明顯，但口感變差，食用后舌頭發(fā)麻，黃秋葵汁液添加量越多舌頭發(fā)麻感覺越明顯。

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交試驗，其正交試驗結(jié)果表3。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results

由表3 的正交試驗結(jié)果和極差分析可知，RB＞RC＞RD＞RA，影響黃秋葵酸奶品質(zhì)的因素主要是黃秋葵汁液的添加量，其次是菌種種類和白砂糖的添加量，影響最低的是發(fā)酵時間，由從以上可以得出本次試驗當(dāng)中黃秋葵酸奶的最佳配方是A2B2C3D2，即白砂糖添加量5%，黃秋葵汁添加量6%，菌種植物乳酸菌，發(fā)酵時間4h。該組合條件下進(jìn)行了3 次重復(fù)驗證試驗，所得的黃秋葵酸奶感官評分品均值90 分，高于其它組合。

2.3 體外抗氧化試驗

用植物乳酸菌（3%）在42 ℃，白砂糖添加量5%，發(fā)酵4 h 得到對照組酸奶；植物乳酸菌（3%），白砂糖添加量5%，黃秋葵汁添加量6%，在42 ℃發(fā)酵4 h 得到黃秋葵酸奶。

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

黃秋葵酸奶的DPPH·清除能力見圖4。

圖4 黃秋葵酸奶的DPPH·清除能力Fig.4 Clear ability on DPPH·of okra yogurt

DPPH 自由基是非常有效的自由基捕獲劑，經(jīng)常被用于檢測樣品清除自由基的能力，DPPH 自由基乙醇溶液呈紫色，最大吸收波長為515 nm。如果有其它物質(zhì)提供一個電子使此孤電子被配對，吸收消失或者減弱，導(dǎo)致溶液顏色變淺，在515 nm 處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系。故該法可以用來表征某種物質(zhì)對自由基的清除能力，通常用清除率表示。清除率越大，表明該物質(zhì)對自由基的清除能力越強(qiáng)[24]。如圖4 所示，黃秋葵酸奶對DPPH·清除率均大于對照組酸奶，且清除率隨著酸奶濃度的增大而增大。通過單因素方差分析，在相同酸奶濃度條件下，黃秋葵酸奶對DPPH·的清除率顯著高于對照組酸奶（P＜0.01），且在樣品濃度 50 mg/mL 時，兩者間的清除率差異最大。

2.3.2 羥基自由基（·OH）的清除能力

黃秋葵酸奶的·OH 清除能力見圖5。

圖5 黃秋葵酸奶的·OH 清除能力Fig.5 Clear ability on·OH of okra yogurt

·OH 是目前對生物體危害最大的自由基，可以與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類等物質(zhì)的發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或產(chǎn)生突變，進(jìn)而引起某些疾病。如圖5 所示，黃秋葵酸奶對·OH 清除率均大于對照組酸奶，且對·OH 清除率隨酸奶濃度的增大而增大。通過單因素方差分析，在相同酸奶濃度條件下，黃秋葵酸奶對·OH 的清除率顯著高于對照組酸奶（P＜0.01），且在樣品濃度40 mg/mL 時，兩者間的清除率差異最大。

黃秋葵汁液中含有黃酮、多酚、多糖等抗氧化物質(zhì)，能明顯提高酸奶的抗氧化能力。并且植物乳酸菌發(fā)酵時，釋放的更多得抗氧化物質(zhì)，可以有效提高酸奶的抗氧化能力[17，25-26]。

3 結(jié)果與討論

以植物乳酸菌作為發(fā)酵菌種，白砂糖添加量5%，黃秋葵汁添加量6%，發(fā)酵時間4 h。該組合條件下進(jìn)行了3 次重復(fù)驗證試驗，所得的黃秋葵酸奶感官評分品均值90 分，所得到的產(chǎn)品呈無色、表面光滑、無乳清析出、酸甜適度、口感細(xì)膩、具有淡淡的黃秋葵清香，對DPPH·和·OH 的清除能力明顯高于普通酸奶。但是不同菌種發(fā)酵引起酸奶的抗氧化能力增強(qiáng)的機(jī)制有待深入研究。