薛雨菲 張 玥 程怡媚 馬舒婕 孫 乾 李 芳 孔令明

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052； 2. 新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830021)

中國核桃產(chǎn)量已居世界首位，除鮮食外，大部分的核桃被用作榨油，但榨油后副產(chǎn)物的綜合利用，以及優(yōu)質(zhì)核桃蛋白的規(guī)?；⒓s化深加工仍存在一定的不足。核桃蛋白中的谷蛋白與醇溶蛋白占總蛋白的70%～80%，且谷蛋白只溶于稀酸或稀堿溶液中，不溶于水或油，相對(duì)活性差，導(dǎo)致核桃蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用較少[1]。

酶解可使深藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部的親水性基團(tuán)逐漸暴露而改善蛋白質(zhì)的功能特性[2-3]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TG)的交聯(lián)化能促進(jìn)蛋白質(zhì)分子向超大型、網(wǎng)狀化形成，從而使得蛋白分子具有更為強(qiáng)勁的凝膠化性能[4]。Hu等[5]在研究中指出，酶法可改善蛋白質(zhì)的乳化活性，但相應(yīng)的乳化穩(wěn)定性卻有一定程度的下降。酶法改性能使改性后的大豆蛋白在乳化穩(wěn)定性[6]、起泡性、凝膠性以及熱穩(wěn)定性上有較為顯著的改變，因此對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶法改性并分析蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，對(duì)解釋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其功能特性的關(guān)系，以及擴(kuò)大在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的重要意義[7]。

試驗(yàn)擬選用TG酶改性核桃蛋白，輔以光譜圖分析，探究蛋白親疏水性的變化，定性定量分析蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及基團(tuán)變化，旨在為酶法改性核桃蛋白使核桃餅粕中的優(yōu)質(zhì)蛋白得到更為全面的利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕：新疆中亞食品研發(fā)中心有限公司；

核桃谷蛋白(WG)：實(shí)驗(yàn)室自制；

大豆油：新疆友好集團(tuán)股份有限公司；

復(fù)合蛋白酶：120 U/mg，南寧龐博生物工程有限公司；

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶：100 U/g，北京索來寶科技有限公司；

透析袋：截留相對(duì)分子質(zhì)量8 000～14 000，北京卓立漢光儀器有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、NaOH、HCl：分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、5-5’-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、乙二胺四乙酸(EDTA)：分析純，美國Sigma公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

便攜式數(shù)顯pH計(jì)：Testo205型，德圖儀表(深圳)有限公司；

電子天平：PL203型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-S-6型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；

低速離心機(jī)：TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

紫外—可見分光光度計(jì)：TU-1810PC型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：ALPHA 1-2型，德國 Marin Christ公司；

定時(shí)恒溫磁力攪拌器：RSH-1DR型，上海貝侖儀器設(shè)備有限公司；

漩渦振蕩器：GL-866型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

圓二色譜儀：J-810型，日本JASCO公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃谷蛋白及改性蛋白的制備

(1) 核桃谷蛋白工藝提?。焊鶕?jù)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行修改。

核桃餅粕→脫脂核桃粕→加去離子水→離心→沉淀→加NaCl→離心→沉淀→加70%乙醇→離心→沉淀→加NaOH調(diào)pH值→離心→上清液→加HCl調(diào)pH至等電點(diǎn)→離心→沉淀→水洗至中性→真空冷凍干燥→核桃谷蛋白

(2) 脫酰胺谷蛋白工藝流程：

WG→制備溶液(蛋白質(zhì)濃度6%～8%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))→攪拌→調(diào)pH 7.0→加酶(40 ℃，40 min，酶用量0.3%)→滅酶(90 ℃水浴10 min)→冷卻→水洗至中性→真空冷凍干燥→脫酰胺酶解核桃谷蛋白(CPMP)

(3) 交聯(lián)化工藝流程：

WG→加磷酸緩沖液溶解(蛋白質(zhì)濃度6%～8%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))→攪拌→加酶→混勻振蕩反應(yīng)→滅酶(90 ℃水浴10 min)→冷卻→水洗至中性→真空冷凍干燥→TG酶改性核桃谷蛋白(TGMP)

1.3.2 熒光分光光度分析 根據(jù)文獻(xiàn)[9]修改如下：將蛋白稀釋于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，使其質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL。調(diào)整激發(fā)波長為310 nm，發(fā)射波長為450 nm，選擇發(fā)射波長的測(cè)定范圍為400～500 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，掃描速率1 200 nm/min，掃描電壓450 mV。每個(gè)樣品重復(fù)做3次掃描。

1.3.3 紫外分光光度分析 將蛋白稀釋于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，使其質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。取約5 mL樣液倒入1 cm石英比色皿中，用分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度值，掃描波長200～400 nm。每個(gè)樣品重復(fù)做3次掃描。

1.3.4 巰基與二硫鍵測(cè)定

(1) 游離巰基含量：取30 mg蛋白樣品分散于Ellman’s試劑中， 4 800 r/min離心15 min，412 nm處測(cè)量，每個(gè)樣品重復(fù)做3次測(cè)定。

(2) 總巰基含量：稱取30 mg蛋白溶于10.0 mL混合試劑(精確稱取20.84 g Tris、13.51 g甘氨酸、2.98 g EDTA二鈉和960.96 g碳酰二胺，加去離子水定容至1 000 mL)中， 412 nm處測(cè)量，每個(gè)樣品重復(fù)做3次測(cè)定。按式(1)計(jì)算巰基含量。

(1)

式中：

SH——巰基含量，μmol/g；

73.53——消光轉(zhuǎn)化系數(shù)，μmol/L；

A412——412 nm處測(cè)得的吸光度；

D——上清液稀釋倍數(shù)；

C——上清液中蛋白含量，mg/mL。

(3) 二硫鍵：取50 mg蛋白樣品分散于100 μL Tris-base緩沖液中，再加入到NTSB溶液中，室溫下靜置1 h，10 000 r/min離心10 min，412 nm處測(cè)量，對(duì)照組加入NTSB溶液。

1.3.5 圓二色光譜分析 精確稱取WG樣品溶解于pH 7.0的磷酸緩沖液中，使蛋白濃度為0.3 mg/mL。在25 ℃條件下放置3 h，采用圓二色光譜儀測(cè)定WG的圓二色性。取約5 mL樣液置于2 mm石英比色皿中，掃描波長190～250 nm，掃描速率100 nm/min，響應(yīng)溫度25 ℃，靈敏度100 mdeg/cm，分辨率0.5 nm。所測(cè)出的圖譜需扣除緩沖液的空白差，每個(gè)樣液重復(fù)掃描8次取平均值，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)采用JASCO結(jié)構(gòu)軟件進(jìn)行分析，圓二色性以殘基摩爾橢圓率表示(℃·cm2/dmol)。

1.3.6 氮溶指數(shù)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[10]并做一定修改，精確稱量2 g凍干后的酶解產(chǎn)物，分散于去離子水中，定容至50 mL。室溫下振蕩2 h，4 500 r/min離心20 min，取5 mL上清液用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，每個(gè)樣品重復(fù)做3次測(cè)定。按式(2)計(jì)算氮溶指數(shù)。

(2)

式中：

NSI——酶解產(chǎn)物的氮溶指數(shù)，%；

N1——5 mL上清液中的可溶性氮，mg；

N2——2 g樣品中的總氮，mg；

1.3.7 持水性的測(cè)定 參考Paredeslopez等[11]的方法并略作修改，準(zhǔn)確稱取0.10 g WG和改性蛋白置于離心管中，加入10 mL去離子水，4 500 r/min離心15 min。稱取樣品和離心管質(zhì)量，每個(gè)樣品重復(fù)做3次測(cè)定。按式(3) 計(jì)算持水性。

(3)

式中：

WHC——持水性，g/g；

M0——樣品質(zhì)量，g；

M1——離心管與樣品總質(zhì)量，g；

M2——離心管與沉淀物質(zhì)量，g。

1.3.8 持油性的測(cè)定 依照Pedroche等[12]的方法并略作修改，準(zhǔn)確稱取0.10 g WG和改性蛋白置于離心管中，加入大豆油5 mL，漩渦式震動(dòng)60 s，3 300 r/min離心15 min，吸紙吸去殘留油脂，每個(gè)樣品重復(fù)做3次測(cè)定。按式(4)計(jì)算持油性。

(4)

式中：

FBI——持油性，g/g；

M0——樣品質(zhì)量，g；

M1——離心管與樣品總質(zhì)量，g；

M2——吸油后離心管與樣品總質(zhì)量，g。

1.3.9 乳化及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

(1) 乳化性：根據(jù)文獻(xiàn)[13]略作修改。取5 mL樣液于25 mL蒸餾水和20 mL大豆油混合液中，漩渦震蕩60 s，2 500 r/min離心乳化5 min，讀取乳化層高度，測(cè)定3次取平均值。按式(5)計(jì)算乳化性。

(5)

式中：

EA——乳化性，%；

H1——離心管中乳化層高度，cm；

H——離心管中液體總高度，cm。

(2) 乳化穩(wěn)定性：稱取5 g樣品溶于100 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)至pH 7.0，加入50 mL大豆油，高速攪拌器中10 000 r/min 均質(zhì)2 min，50 ℃水浴30 min后，測(cè)出此時(shí)的乳化層高度，并且記錄30 min后的乳化層高度。測(cè)定3次取平均值。按式(6)計(jì)算乳化穩(wěn)定性。

(6)

式中：

ES——乳化穩(wěn)定性，%；

H0——0 min乳化層高度，cm；

H1——30 min乳化層高度，cm。

1.3.10 起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[14]修改如下，按1%的質(zhì)量濃度將樣品溶解于pH 7.0的10 mmol/L 磷酸緩沖溶液中，取10.0 mL置于25 mL離心管中，10 000 r/min均質(zhì)2 min；快速記錄均質(zhì)停止時(shí)的總體積和放置30 min后的總體積，測(cè)定3次取平均值。按式(7)、(8)分別計(jì)算起泡性與泡沫穩(wěn)定性。

(7)

(8)

式中：

FA——起泡性，%；

FS——泡沫穩(wěn)定性，%；

V0——初始樣液體積，mL；

V1——均質(zhì)放置0 min后樣液總體積，mL；

V2——均質(zhì)放置30 min后樣液總體積，mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，運(yùn)用Excel 2003進(jìn)行圖形繪制，光譜圖采用系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

由圖1可知，在310 nm的激發(fā)波長處所產(chǎn)生的熒光光譜主要是由于谷蛋白中存在一定量的色氨酸所造成的，譜圖上顯示的熒光峰實(shí)質(zhì)為色氨酸基團(tuán)由于光激發(fā)產(chǎn)生的電子躍遷所導(dǎo)致，峰的位置為428～432 nm。利用CPMP與TGMP適度地酶解蛋白，使蛋白分子水解成多肽以及肽鏈，打開了蛋白質(zhì)卷曲的結(jié)構(gòu)，分子鏈逐漸展開，側(cè)鏈的改變會(huì)影響蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[15]。改變蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)所處的微環(huán)境，都可以使蛋白質(zhì)中氨基酸發(fā)生相應(yīng)變化，一部分色氨酸從疏水性區(qū)域游離到親水性區(qū)域，其氨基酸殘基暴露在極性環(huán)境下，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度下降；另一部分色氨酸逐漸被包埋于分子內(nèi)部，其所處的微環(huán)境極性降低，也導(dǎo)致了熒光強(qiáng)度下降[16]。親水性基團(tuán)的暴露，疏水基團(tuán)的包埋，使得親水性極大增強(qiáng)，溶解度極大提高。

圖1 核桃谷蛋白與改性蛋白的熒光光譜

2.2 紫外光譜分析

由圖2可知，WG的最大紫外吸收波長為284 nm，反映了WG的紫外吸收主要是其蛋白內(nèi)的色氨酸和絡(luò)氨酸殘基發(fā)生必變所引起的。WG的最高紫外吸收峰出現(xiàn)在284 nm處的0.470，而CPMP是0.498，其高低順序依次為TGMP>CPMP>WG。所有改性蛋白的吸收峰均出現(xiàn)在275～279 nm，蛋白紫外吸收峰出現(xiàn)了藍(lán)移，說明色氨酸、絡(luò)氨酸等殘基基團(tuán)所處微環(huán)境的極性狀態(tài)發(fā)生了改變，這種改變也相應(yīng)會(huì)引起肽鍵的斷裂[17]。

圖2 核桃谷蛋白與改性蛋白的紫外光譜

2.3 巰基與二硫鍵分析

由圖3可知，WG的游離巰基和二硫鍵含量分別為22.78，7.02 μmol/g。WG的大部分巰基都游離在蛋白質(zhì)表面，而改性蛋白的巰基相對(duì)WG均是包埋在分子內(nèi)部。在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中，巰基和二硫鍵是維持蛋白分子空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及改變一定功能特性的重要化學(xué)鍵[18]，這些化學(xué)鍵的斷裂、結(jié)合、重組都可使蛋白質(zhì)的更高級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的變化，而這些變化往往又與蛋白質(zhì)的功能特性緊密結(jié)合。

2.4 圓二色光譜分析

如圖3所示，210 nm處的負(fù)峰顯示了蛋白質(zhì)具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，而α-螺旋結(jié)構(gòu)過于穩(wěn)定，在一定程度上會(huì)阻止蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)趨于穩(wěn)定狀態(tài)，不利于蛋白質(zhì)功能特性的改變[19]；相比α-螺旋結(jié)構(gòu)，β-折疊與無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)使得蛋白穩(wěn)定性較差。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖4 核桃谷蛋白與改性蛋白的圓二色光譜

由表1可知，未改性的WG二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊，且α-螺旋結(jié)構(gòu)占17.62%，為改性蛋白的1.27倍。經(jīng)酶法改性的CPMP與TGMP雖有一定變化趨勢(shì)，但表現(xiàn)不明顯；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在整體上變化不明顯，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在一定程度上有所變化。

2.5 功能指標(biāo)的測(cè)定

由表2可知，通過改性前后的數(shù)據(jù)對(duì)比分析，CPMP與TGMP的氮溶指數(shù)分別為40.61%，34.29%，氮溶指數(shù)提高了133.01%，96.75%，持水性提高了23.19%，22.25%，與沈敏江等[20]的研究結(jié)果一致。Tsumura等[21]研究發(fā)現(xiàn)，酶法改性可有效改善大豆蛋白的功能特性，主要與蛋白質(zhì)的水解和交聯(lián)有關(guān)；沈敏江等[20]研究發(fā)現(xiàn)氮溶指數(shù)由8.74%上升至78.16%。

CPMP與TGMP的持油性均出現(xiàn)了一定的下降，可能是因?yàn)槊阜ǜ男暂^為溫和，在暴露親水基團(tuán)的同時(shí)也在釋放疏水性基團(tuán)，而預(yù)先暴露出來的親水性氨基酸阻止了疏水性氨基酸的暴露，導(dǎo)致疏水性氨基酸不能完全暴露，持油性較差。TG酶的催化作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隨著多肽的產(chǎn)生和肽鏈的舒展，更多的疏水基團(tuán)與疏水區(qū)域的暴露會(huì)直接增加蛋白的持油性，但提高幅度并不明顯；而因?yàn)門G酶所產(chǎn)生的交聯(lián)化作用，其空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸緊密，且TG酶也相應(yīng)發(fā)生脫酰胺化，因此也會(huì)提升蛋白的持水性。楊淼等[22]認(rèn)為，在水油兩相比中，適當(dāng)提高油相比例可以提高大豆分離蛋白的凝膠持水性，提高大豆分離蛋白的乳化性狀；而在大豆蛋白的相應(yīng)產(chǎn)品中，TG酶常被用作一種凝膠乳化劑以提升產(chǎn)品的乳化能力和膠凝程度[23]。

表1 核桃谷蛋白與改性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化對(duì)比

表2 改性前后功能特性比較

在乳化特性與起泡特性上，采用酶法改性處理WG能夠提高氮溶指數(shù)，同時(shí)對(duì)乳化特性有一定程度的提高。Guan等[24]指出，一般情況下，蛋白質(zhì)的溶解性較好，蛋白的其他功能特性也相應(yīng)較好；而沈敏江等[20]卻認(rèn)為，使用酶法改性WG，雖然其乳化性有一定提升，但乳化穩(wěn)定性卻呈現(xiàn)出顯著下降，并指出可能是因?yàn)槊附馄茐牧撕颂业鞍椎膬?nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致非極性基團(tuán)逐漸暴露，因?yàn)槊附庖矔?huì)相應(yīng)生成多肽和小分子肽，這些肽類黏滯在油分子表面，阻止了核桃蛋白的乳化穩(wěn)定性。

由表2還可知，CPMP與TGMP的起泡特性無明顯變化。Kong等[25]發(fā)現(xiàn)有限的酶解可使蛋白質(zhì)分子向多肽轉(zhuǎn)變，而多肽鏈相比蛋白質(zhì)具有較高的表面活性，而這種活性會(huì)促使核桃蛋白功能特性有所改善。Gan等[26]則發(fā)現(xiàn)TG酶對(duì)小麥蛋白的改性會(huì)顯著提高蛋白的乳化性、起泡性以及凝膠性，且提高幅度均在55%以上，但其穩(wěn)定性卻都有略微的降低。這是由于TG酶能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)中的谷氨酸以及賴氨酸殘基產(chǎn)生交聯(lián)化，這種交聯(lián)化反應(yīng)使得蛋白質(zhì)分子間以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)都逐漸發(fā)生交聯(lián)，交聯(lián)促進(jìn)了蛋白分子的緊密結(jié)構(gòu)，優(yōu)化了蛋白的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些原因均改善了蛋白功能特性。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)復(fù)合蛋白酶與TG酶改性后的核桃蛋白其溶解度有較大幅度的提升，持水能力也表現(xiàn)出一定的升高，但持油性卻有一定的下降；乳化特性與起泡特性也有相應(yīng)的變化。結(jié)合光譜圖的分析，更加明確了核桃蛋白在酶法改性時(shí)，蛋白的親水性以及疏水性會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，蛋白中氨基酸殘基的極性狀態(tài)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，其內(nèi)部的色氨酸與外部環(huán)境(pH、溫度等)的改變，也會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變；也為核桃的定性分析提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。 蛋白的游離巰基是決定親水性的主要原因，蛋白分子內(nèi)部以及分子間化學(xué)鍵的變化，能反作用于其所形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，而結(jié)構(gòu)表征性的變化又會(huì)影響到蛋白外在的功能特性的變化。但目前試驗(yàn)仍處于對(duì)結(jié)構(gòu)表征的論述，未從蛋白組學(xué)的角度出發(fā)，對(duì)作用于氨基酸位點(diǎn)上的深層次機(jī)理加以闡述，且在實(shí)際應(yīng)用中還有待于更深入的開發(fā)和完善。