陳 曉，朱 斌，楊 陽，安曉娟，胡翠玲

0 引言

拉莫三嗪(Lamotrigine，LTG)和卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)均為治療癲癇的常用藥物，二者單用或聯(lián)合應(yīng)用治療復(fù)雜性癲癇發(fā)作。無論是實(shí)施臨床治療藥物監(jiān)測(cè)，以達(dá)到合理個(gè)體化用藥，還是進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，均需要準(zhǔn)確快速的血藥濃度檢測(cè)方法。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的方法包括高效液相色譜法(HPLC)[1-4]，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)[5-7]等，多為檢測(cè)單一藥物，且分析時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)檢測(cè)多種藥物將會(huì)大大提高藥物分析效率。而且文獻(xiàn)報(bào)道的前處理方法-液液萃取法或固相萃取[2,3,6-9]比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究旨在建立一種樣品處理簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的超高液液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)法，同時(shí)測(cè)定拉莫三嗪和卡馬西平的血藥濃度，以滿足臨床研究的需要。

1 材料與方法

1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品 卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：C0450000，純度≥98%)；拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：T6062，純度≥98%)；內(nèi)標(biāo)：西替利嗪(Cetirizine，CTZ)標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：C0980650，純度≥98%)；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器 串聯(lián)質(zhì)譜儀4000 QTRAP (美國(guó)Applied Biosystems公司)；液相色譜儀ACQUITY UPLC H-Class System(美國(guó)沃特世公司)；渦旋混合器(XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；低速離心機(jī)(5417R 型，EPPENDORF，德國(guó))；分析天平(TB-114，DENVER，USA)；Millipore Direct-Q3型純水機(jī)等。

1.3 檢測(cè)條件

1.3.1 液相條件 采用Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，流速：0.3 ml/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μl，樣品分析時(shí)間為3 min，流動(dòng)相為甲醇(A)和0.1%甲酸(B梯度洗脫。流動(dòng)相梯度洗脫程序：在 0～1.0 min 5% A，1.0～1.9 min線性增加至95%，在 1.9～ 2.4 min內(nèi)A保持95%，在2.4～2.6 min內(nèi)A線性降低至5%，然后A相保持5%至3 min，總分析時(shí)間為3 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧(ESI)離子源，選用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)在正離子電離模式下進(jìn)行質(zhì)譜掃描測(cè)定，拉莫三嗪、卡馬西平和內(nèi)標(biāo)西替利嗪的離子對(duì)分別為m/z256.0→211.2、m/z237.0→194.1和m/z389.2→201.2。儀器參數(shù)設(shè)置如下，Cur：10 psi，CAD：medium，IS：5 000 eV，TEM：300 ℃，GS1：50 psi，GS2：20 psi，DP：120 V，EP：10 V；CXP：15 V，CE：37 V(LTG)、27 V(CBZ)、27 V(CTZ )。每個(gè)通道時(shí)間為200 ms。

1.4 溶液配制 精密稱取拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用 1.0 ml甲醇溶解，移入10.0 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得1 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于冰箱-20 ℃保存。再用甲醇梯度稀釋，配制各濃度100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于冰箱-20 ℃保存。

卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制方法同上所述，得1.0 mg/ml。同樣再用甲醇梯度稀釋，配制各濃度 100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于冰箱-20 ℃保存。然后將等體積的拉莫三嗪和卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)工作液混合，得50、100、250、500、1 000、2 500、5 000、10 000 ng/ml的混合標(biāo)曲標(biāo)準(zhǔn)工作液，另外，配制QC標(biāo)準(zhǔn)工作液低、中、高濃度分別為100、2000、8 000 ng/ml，置于冰箱-20 ℃保存待用。

精密稱取內(nèi)標(biāo)西替利嗪標(biāo)準(zhǔn)品 0.010 0 g，用1 ml甲醇溶解，移入10 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得1.0 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇梯度稀釋至1 000 ng/ml，置于冰箱-20 ℃保存待用。

1.5 樣本處理 精密吸取血漿樣品100 μl，置于1.5 ml的離心管中，加入內(nèi)標(biāo)西替利嗪溶液10 μl，旋渦10 s混勻后，加入500 μl甲醇，旋渦振蕩1 min，15 000 r/min離心10 min，吸上清液150 μl于進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣10 μl。

2 方法學(xué)確證

2.1 專屬性 LTG、CBZ的準(zhǔn)離子峰分別為m/z256.0和m/z237.0，二級(jí)質(zhì)譜分析生成的主要碎片離子分別為m/z211.2和m/z194.1，內(nèi)標(biāo)CTZ的準(zhǔn)離子峰和主要碎片離子峰分別為m/z389.2和m/z201.2。LTG、CBZ和CTZ標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見圖 1。取空白血漿100 μl，按“1.5”項(xiàng)下方法操作，得到相應(yīng)色譜圖；另取空白血漿100 μl 3份，分別加入質(zhì)量濃度均為50 ng/ml的LTG標(biāo)準(zhǔn)溶液、CBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μl，按“1.5”項(xiàng)下操作，得到相應(yīng)色譜圖，見圖2。

圖1 質(zhì)譜圖

注：A.拉莫三嗪m/z256.0→211.2，B.卡馬西平m/z237.0→194.1，C.西替利嗪m/z389.2→201.2

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 精密吸取人空白血漿 90 μl，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍分別加入LTG和CBZ的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 10 μl，輕渦混勻制備成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，加入內(nèi)標(biāo)CTZ溶液10 μl，按上述“1.5”生物樣品與處理方法處理后，進(jìn)行UPLC分析，橫坐標(biāo)為已知濃度，縱坐標(biāo)為分析所得不同濃度分析物峰面積與待測(cè)物峰面積之比，使用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算(權(quán)重系數(shù)為1/X2)，得LTG標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.001 1X-0.002 8 (R2=0.999 5)，CBZ標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.002 2X-0.024 8 (R2=0.997 5)。結(jié)果表明，LTG和CBZ血藥濃度均在 5～1 000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。LTG和CBZ的定量下限均為5 ng/ml(S/N>10)。

圖2 色譜圖

2.3 回收率和基質(zhì)效應(yīng) 制備人血漿中LTG和CBZ各質(zhì)控濃度的樣品(平行5個(gè)樣本)，按上述“1.5”項(xiàng)生物樣品與處理方法處理后，進(jìn)行 UPLC-MS/MS分析，得目標(biāo)分析物峰面積為A1，目標(biāo)分析物峰面積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得濃度 C；取空白人血漿樣品數(shù)份，按“1.5”樣品處理方法處理后，用所得溶液配制各質(zhì)控濃度的分析物等標(biāo)溶液(各平行 5 個(gè)樣本)，進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析，得峰面積為A2；按“(A1/A2)×100%”計(jì)算提取回收率，LTG和CBZ提取回收率分別為81.3%～84.9 %和82.7～87.3 %。同時(shí)，制備目標(biāo)分析物等濃度標(biāo)液，進(jìn)樣分析，得其峰面積為A3，依“(A2/A3)×100%”來考察基質(zhì)效應(yīng)。通過相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)反映基質(zhì)效應(yīng)的大小?；|(zhì)效應(yīng)RSD值應(yīng)在±15%范圍內(nèi)。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度 制備LTG和CBZ各質(zhì)控濃度生物樣品(平行5個(gè)樣本)，按上述“1.5”生物樣品與處理方法處理后，進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析，考察方法的批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；通過在連續(xù)不同天處理并檢測(cè)3個(gè)合格的分析批樣品?？疾旆椒ǖ呐g精密度和準(zhǔn)確度。精密度的RSD值在±15%范圍內(nèi)，準(zhǔn)確度為85%～115%，見表1。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 見表2。取低(10 ng/ml )、中(200 ng/ml )、高(800 ng/ml )的血漿樣品，分別于室溫放置 0、12 h 后測(cè)定其回收率。每個(gè)條件下每個(gè)濃度點(diǎn)考察6份平行樣本，結(jié)果表明，處理后的血漿樣品室溫放置 12 h內(nèi)穩(wěn)定(RSD<12.5%)。同法配制低、中、高質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品各5份置于-20 ℃放置30 d，按“1.5”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其回收率，考察長(zhǎng)期穩(wěn)定性(RSD<13.4 %)。配制低、中、高質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品各5份，置于-20 ℃，冷凍-解冷凍循環(huán)3次后，進(jìn)樣分析，考察反復(fù)凍融穩(wěn)定性(RSD<14.8 %)。

表1 提取回收率、精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果(n=5)

表2 樣本穩(wěn)定性考察結(jié)果(n=5)

3 討論

本研究采用甲醇蛋白沉淀的前處理方法，簡(jiǎn)便快速，同時(shí)使用ACQUITY BEH C18UPLC色譜柱，優(yōu)化流動(dòng)相后分析時(shí)間縮短至3 min，大大提高了分析效率。而且同時(shí)檢測(cè)卡馬西平和拉莫三嗪，標(biāo)曲范圍覆蓋臨床患者體內(nèi)的藥物濃度，非常適用于臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究和治療藥物監(jiān)測(cè)。