于江,于貞

(1.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005; 2.山東魯花生物科技有限公司，山東 萊陽 265200)

米曲霉因為具有分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶和纖維素酶等酶的能力，成為醬油等調(diào)味品生產(chǎn)的主要菌株[1,2]，同時米曲霉也能分泌曲酸、琥珀酸等有機酸，從而對醬油的品質(zhì)具有重要影響[3-5]。琥珀酸二鈉目前作為國家承認(rèn)的食品添加劑，已廣泛應(yīng)用于方便面海鮮湯料、肉制品、醬油、海鮮類等食品及其加工領(lǐng)域[6,7]。琥珀酸能提高醬油的鮮味，帶來令人愉快的口感，而且琥珀酸不具有揮發(fā)性，能夠長時間保持醬油的鮮味[8,9]。高端醬油的發(fā)展趨勢是不添加任何防腐劑，而醬油中琥珀酸具有防腐功能，恰好滿足了這一要求。成品醬油中添加琥珀酸不被消費者接受，如果是米曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，更容易被消費者接受。目前我國醬油釀造普遍采用米曲霉AS 3.042菌株或其誘變菌株，在醬油發(fā)酵過程中產(chǎn)生的琥珀酸濃度很低，成品醬油中的琥珀酸濃度根本達(dá)不到口味閾值[10]，因此需要對米曲霉孢子進(jìn)行誘變，誘變的方法有很多，如紫外誘變和亞硝基胍誘變[11-14]，本文對米曲霉孢子的原生質(zhì)體先進(jìn)行紫外誘變再進(jìn)行亞硝基胍誘變后得到高產(chǎn)琥珀酸的菌株ASQ-1，然后利用該菌株進(jìn)行醬油的發(fā)酵，并對壓榨醬油的各項理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，以期為該菌株的工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗菌株：米曲霉AS3.042、米曲霉ASQ-1，煙臺大學(xué)生物工程實驗室保藏。

實驗原料：豆粕、小麥粉，均由山東魯花生物科技有限公司提供。

制曲設(shè)備：制曲設(shè)備和場地由山東魯花生物科技有限公司提供。

1.2 主要實驗儀器

K9860凱氏定氮儀、SH220石墨消解儀 濟南海能儀器有限公司；GZX-9246MBE電熱恒溫干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 主要試劑

氫氧化鈉、硝酸銀、鉻酸鉀、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、硼酸、鹽酸、乙醇、甲基紅、溴甲酚綠：均為分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 成曲制備

分別對米曲霉ASQ-1和AS3.042進(jìn)行制曲。將豆粕和小麥粉干料按照6∶4進(jìn)行混合，然后以豆粕潤水量52%進(jìn)行潤水。利用蒸汽蒸煮30 min，冷卻至40 ℃左右進(jìn)行接種，接種量為3.3×106個/g。接種完畢后在32 ℃條件下培養(yǎng)89 h，在培養(yǎng)時間達(dá)到12 h和48 h時進(jìn)行翻曲，達(dá)到培養(yǎng)時間后結(jié)束培養(yǎng)。

1.4.2 醬油發(fā)酵

醬油發(fā)酵采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝。分別將米曲霉ASQ-1和AS3.042制備的成曲與鹽水(NaCl含量22%)按照1∶2.2(質(zhì)量體積比)比例混合，攪拌均勻后，置于30 L發(fā)酵罐中，在室溫進(jìn)行靜態(tài)發(fā)酵，每種成曲3個重復(fù)。每隔15 d攪拌1次，發(fā)酵3個月后，取醬醪進(jìn)行過濾，獲得醬油原汁，對醬油原汁進(jìn)行理化指標(biāo)檢測。

1.5 理化指標(biāo)檢測

琥珀酸的檢測：高效液相色譜法[15,16]。

釀造醬油理化指標(biāo)的檢測：釀造醬油理化指標(biāo)參照國標(biāo)GB 18186-2000進(jìn)行檢測，包括可溶性無鹽固形物、總酸、氨基酸態(tài)氮的檢測。

pH的檢測：利用pH計檢測。

全氮和銨鹽的檢測：利用凱氏定氮儀檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 醬油原汁中琥珀酸含量對比

取發(fā)酵3個月的醬醪，過濾，檢測其琥珀酸含量，以米曲霉AS3.042醬油原汁為對照，檢測結(jié)果見圖1。

圖1 醬油原汁琥珀酸含量對比

由圖1可知，ASQ-1醬油原汁中琥珀酸含量為0.488 g/L，對照醬油原汁中琥珀酸含量為0.075 g/L，ASQ-1菌株發(fā)酵生產(chǎn)的醬油中琥珀酸含量較對照高6.5倍。該結(jié)果證明ASQ-1應(yīng)用到醬油發(fā)酵中能夠大幅度提高醬油原汁中琥珀酸的含量。

2.2 醬油原汁中總酸和pH值對比

總酸和pH值是醬油質(zhì)量的重要指標(biāo)。取發(fā)酵3個月的醬油原汁，檢測其總酸和pH值。ASQ-1發(fā)酵生產(chǎn)的醬油原汁和對照醬油原汁中總酸含量和pH值見圖2。

圖2 醬油原汁總酸含量和pH值對比

由圖2可知，ASQ-1和對照的總酸含量和pH值均相差不大。誘變屬于不可控制的篩選，由結(jié)果可知，應(yīng)用ASQ-1發(fā)酵醬油不會對總酸和pH值造成影響。

2.3 醬油原汁中含氮化合物對比

取發(fā)酵3個月的醬油原汁，檢測其全氮、銨鹽和氨基酸態(tài)氮，結(jié)果見圖3。

圖3 醬油原汁含氮指標(biāo)對比

由圖3可知，采用菌株ASQ-1發(fā)酵生產(chǎn)的醬油原汁中的氨基酸態(tài)氮含量與對照相同，均為1.04 g/dL；ASQ-1發(fā)酵生產(chǎn)的醬油原汁中銨鹽和全氮含量分別為0.21 g/dL和1.11 g/dL，對照醬油原汁中銨鹽和全氮含量分別為0.27 g/dL和1.13 g/dL，ASQ-1醬油原汁中銨鹽和全氮含量小于對照，其中ASQ-1醬油原汁中銨鹽含量占全氮的18.92%，對照醬油原汁中銨鹽含量占全氮的18.58%。銨鹽含量越低，醬油質(zhì)量越高，GB 18186-2000中規(guī)定銨鹽含量應(yīng)低于全氮含量的30%，ASQ-1菌株發(fā)酵的醬油原汁符合該標(biāo)準(zhǔn)。對照的醬油原汁中全氮含量高于ASQ-1醬油原汁，這可能是由于其銨鹽含量較高。上述結(jié)果證明利用ASQ-1發(fā)酵的醬油原汁中氨基酸等含氮風(fēng)味物質(zhì)與其出發(fā)菌株相似，未造成不良影響。

2.4 醬油原汁中可溶性無鹽固形物對比

醬油原汁中可溶性無鹽固形物含量見圖4。

圖4 醬油原汁中可溶性無鹽固形物含量對比

可溶性無鹽固形物是醬油風(fēng)味的另一重要指標(biāo)，一般包含氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類和有機酸等。結(jié)果顯示，ASQ-1醬油原汁中可溶性無鹽固形物與對照值相差不大，分別為10.12 g/dL和10.1 g/dL。該結(jié)果說明ASQ-1發(fā)酵生產(chǎn)的醬油原汁除琥珀酸外整體風(fēng)味物質(zhì)的改變不大。

2.5 討論

在ASQ-1誘變篩選的過程中，僅以琥珀酸含量的高低作為篩選指標(biāo)，所以需要進(jìn)行發(fā)酵實驗來驗證是否會出現(xiàn)負(fù)突變的現(xiàn)象。從ASQ-1發(fā)酵生產(chǎn)的醬油原汁與對照的理化指標(biāo)結(jié)果來看，ASQ-1與對照相比，醬油原汁的主要風(fēng)味物質(zhì)指標(biāo)如氨基酸態(tài)氮、總酸和可溶性無鹽固形物均相同，而銨鹽含量較對照有所降低，相應(yīng)的全氮含量也偏低。從此結(jié)果來看，ASQ-1并未產(chǎn)生負(fù)突變，且利用其進(jìn)行醬油發(fā)酵能夠顯著提高琥珀酸含量，提高醬油鮮味。除此之外，兩者pH值同樣，這為二者的相互比較提供了一個穩(wěn)定的pH值環(huán)境。綜合各項理化指標(biāo)結(jié)果表明ASQ-1在提高醬油質(zhì)量、提升醬油中琥珀酸含量方面具有極高的潛力，本研究為富產(chǎn)琥珀酸的米曲霉在工業(yè)上的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

3 小結(jié)

利用ASQ-1作為菌種制備成曲，然后進(jìn)行高鹽稀態(tài)發(fā)酵，在發(fā)酵時間為3個月的醬油原汁中琥珀酸含量為0.488 g/L，是同等條件下對照的6.5倍。

利用ASQ-1發(fā)酵得到的醬油的理化指標(biāo)與對照(米曲霉AS3.042)相似，其中總酸、pH和氨基酸態(tài)氮指標(biāo)相同，可溶性無鹽固形物含量相差不大，銨鹽和全氮略低于對照。ASQ-1在提高醬油琥珀酸含量方面具有極高的潛力。