邵棟梁 安徽國(guó)科檢測(cè)科技有限公司 合肥 230051 Anhui Guoke Test Technology Co., Ltd, Hefei 230051

安徽省科技重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目“安徽省地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品指紋圖譜庫(kù)構(gòu)建及區(qū)塊鏈追溯技術(shù)應(yīng)用研究” 18030701203

氯霉素是一種具有旋光活性的酰胺醇類(lèi)抗生素，是一種高效廣譜的抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用。長(zhǎng)期食用氯霉素殘留超標(biāo)的食品可能引起腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致消化機(jī)能紊亂。人體過(guò)量攝入氯霉素可能引起人肝臟和骨髓造血機(jī)能的損害，導(dǎo)致再生障礙性貧血和血小板減少、肝損傷等健康危害[1]。因此，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和許多國(guó)家限制或禁止氯霉素在畜牧業(yè)中使用。我國(guó)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》（農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)）中規(guī)定，在所有食品動(dòng)物中禁止使用氯霉素。

不確定度是反映檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性的指標(biāo)。檢驗(yàn)人員通過(guò)評(píng)定測(cè)量不確定度可以進(jìn)而評(píng)價(jià)選擇的檢測(cè)方法、找出影響測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素并加以控制，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本文以雞肉為例，按照J(rèn)JF 1059-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[2]及國(guó)標(biāo)方法GB/T 20756-2006《可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯利考?xì)埩袅康臏y(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[3]評(píng)定雞肉中氯霉素檢測(cè)的不確定度，為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)，同時(shí)為測(cè)量其他獸藥殘留量的不確定度評(píng)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

氯霉素（Chloramphenicol）標(biāo)準(zhǔn)溶液和氘代氯霉素（d5-氯霉素）標(biāo)準(zhǔn)溶液（純度均大于99.2%，德國(guó)Dr公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）；超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6495)； 電子天平(梅特勒公司，XSE204)，渦旋儀 (IKA公司)； 冷凍離心機(jī)(德國(guó)貝克曼公司)；超純水發(fā)生器 (Milli Q，密理博公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和工作溶液的配制

精密稱(chēng)取10.0mg的標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈定容至10 mL，制備成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液。精密移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL至100mL容量瓶中加入乙腈并準(zhǔn)確定容至刻度，得到10mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液，再準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，加入空白樣品中，經(jīng)前處理后用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋配制成濃度為0.1、0.5、1、2、5μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 前處理方法

稱(chēng)取5g（精確到0.01g）測(cè)試樣品于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液，加入15mL乙酸乙酯，0.45 mL氫氧化銨，5 g無(wú)水硫酸鈉，勻質(zhì)提取30 s，以4000 r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至50mL比色管中。另取一個(gè)50mL離心管，加入15mL乙酸乙酯，0.45mL氫氧化銨，洗滌勻質(zhì)刀頭10s，洗滌液移入第一支離心管中，用玻棒攪動(dòng)殘?jiān)?，于液體混勻器上渦旋提取1min，超聲波提取5min，以4000 r/min離心5min，上清液合并至50mL比色管中。殘?jiān)偌尤?5mL乙酸乙酯，重復(fù)上述操作，合并全部上清液至50mL比色管中，用乙酸乙酯定容至50mL。搖勻后移取10mL乙酸乙酯提取液于25mL雞心瓶中，在45℃旋轉(zhuǎn)濃縮至干。雞心瓶中的殘?jiān)?mL水溶解，超聲5min，加入3 mL正己烷渦旋混合30s，靜置分層，棄掉上層的正己烷，再加入3mL正己烷渦旋混合30s，靜置分層，移取1mL水相于2mL離心管中，以10000r/min離心5min，過(guò)0.22μm濾膜后，供超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1×50 mm，1.8μm）； 進(jìn) 樣 量：5μL； 流 速：0.3mL/min；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A相：0.1%甲酸溶液，B相：乙腈；梯度洗脫程序：0～1min，維持10%B；1～3min，10% B線性變至60%B；3～5 min，60%B線性變至90%B；5～7min，維持90%B；7～7.1min，線性變至10%B。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3000 V；干燥氣溫度：230℃；干燥氣流速：17 L/min；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：12 L/min；噴嘴電壓：500 V；霧化氣壓力：25 psi。主要質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 氯霉素的主要質(zhì)譜參數(shù)

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)測(cè)定方法，采用內(nèi)標(biāo)法定量，按下式計(jì)算各被測(cè)物含量[4]：

式中：X—試樣中被測(cè)物的殘留量，單位為μg/kg；C—樣液中被測(cè)物的上機(jī)測(cè)試濃度,單位為μg/L；V—凈化液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蟮亩ㄈ蒹w積，單位為mL；實(shí)驗(yàn)中V=1mL；m—待測(cè)樣品質(zhì)量，單位為 g；

考慮到實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各種隨機(jī)因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，在測(cè)量模型中引入重復(fù)性系數(shù)frep[5]，建立樣品中氯霉素殘留量不確定度測(cè)量模型如下：

由測(cè)量模型可看出，影響測(cè)定結(jié)果不確定度Urel(X)的主要因素有：制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的不確定度U1(Cs)；向空白基質(zhì)樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度U2(Cs)；標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(C0)；凈化液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蠖ㄈ蒹w積引入的不確定度Urel(V)，稱(chēng)量樣品引入的不確定度Urel(m)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性（包括提取凈化過(guò)程和儀器進(jìn)樣） 的不確定度通過(guò)Urel(frep)來(lái)體現(xiàn)。溫度引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度很小可忽略不計(jì)。

由此得到試樣中被測(cè)物的殘留量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(X)可由下式計(jì)算：

2 結(jié)果

2.1 制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度U1(Cs)

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量、定容和標(biāo)準(zhǔn)品本身的不確定度決定。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度U11(Cs)

采用分度值為0.0001g的天平，稱(chēng)量10.0 mg的標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)天平檢定證書(shū)，該天平的全程法定允許誤差為±0.0002g，按照均勻分布計(jì)算，則天平稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度U12(Cs)

100ml容量瓶的定容體積引入的不確定度：試驗(yàn)使用A級(jí)容量瓶，其最大允許誤差為±0.1ml，按照均勻分布計(jì)算，則容量瓶檢定引入的不確定度為[6]：

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度U13(Cs)

由供應(yīng)商（或證書(shū)）提供的標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：0.02

制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由公式計(jì)算：

2.2 向空白基質(zhì)樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度U2(Cs)

空白添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取5g（精確到0.01 g）空白試樣于50mL離心管內(nèi)，分別稱(chēng)取5份。分別向其中添加20、100、200、400、1000 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（濃度0.01 μg/mL），制得濃度為0.1、0.5、1、2、5 μg/kg的空白添加試料。體積導(dǎo)致的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算方法與3.1（2）是一樣的，即向空白基質(zhì)樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(C0)

添加5個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品0.1、0.5、1、2、5 μg/kg，按樣品處理步驟操作后上機(jī)，對(duì)應(yīng)上機(jī)濃度0.1、0.5、1、2、5μg/L，每一濃度測(cè)定2次。各種化合物以上機(jī)濃度C為橫坐標(biāo)，譜圖強(qiáng)度峰面積Y為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立數(shù)學(xué)模型：Yi= bCi+a，計(jì)算各化合物線性方程的斜率、截距和相關(guān)系數(shù)，相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 氯霉素回歸直線測(cè)量結(jié)果表

被測(cè)樣品2次平行測(cè)定后，通過(guò)擬合直線求出SR和各化合物濃度C0，根據(jù)公式(1)計(jì)算出被測(cè)樣品中所含各待測(cè)物殘留量X0，按(3)式計(jì)算各待測(cè)物濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U(C0)[7]。

其中Yi―標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積測(cè)定值；Ci―標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值；b―擬合直線的斜率；a―擬合直線的截距；n―標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)室中n=10；p―C0測(cè)試次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中p=5；C0―由線性方程計(jì)算得各化合物濃度；

擬合曲線導(dǎo)致的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

Urel(C0)=U(C0)/C0，有關(guān)量值見(jiàn)表3。

表3 濃度C的不確定度計(jì)算的有關(guān)量值表

2.4 定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(V)

用移液器定容至1mL，1000 μL移液器移取兩次引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 稱(chēng)量樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(m)

稱(chēng)量樣品的天平最大允許誤差：±5mg，采用均勻分布

2.6 實(shí)驗(yàn)合成重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(frep)

按實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定樣品5次，測(cè)得樣品含量為X1～X5，氯霉素含量的平均值X 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(frep)計(jì)算結(jié)果表

標(biāo)準(zhǔn)偏差

參照GB/T 20756-2006《可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯利考?xì)埩袅康臏y(cè)定液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》對(duì)蝦肉里的氯霉素含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)樣品平行測(cè)定5次，取包含因子k=2，

相對(duì)擴(kuò)展不確定度：

Urel(X)=2 Urel(X)=0.0908 (k=2, P=95%)[8]

擴(kuò)展不確定度：

U(X)/(μg/kg) =0.18(k=2, P=95%)

實(shí)測(cè)值：

X/(μg/kg) = 0.49

雞肉中氯霉素的含量為：

(0.49±0.18) (μg/kg) (k=2, P=95%)

3 討論

本研究對(duì)UPLC-MS/MS法測(cè)定雞肉中氯霉素的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定。分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不確定度的來(lái)源和影響因素，并進(jìn)行了各分量的評(píng)定。實(shí)驗(yàn)中雞肉中氯霉素含量測(cè)定結(jié)果表述為(0.51±0.18) μg/kg (k=2, P=95%)。通過(guò)計(jì)算比較發(fā)現(xiàn)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配置、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、檢驗(yàn)過(guò)程的重復(fù)性等引入的不確定度對(duì)測(cè)定結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)較大，在今后的實(shí)際檢測(cè)工作中檢驗(yàn)工作者應(yīng)盡可能規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，減少標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制步驟、精確配制標(biāo)準(zhǔn)曲線并加強(qiáng)規(guī)范性操作，減少隨機(jī)誤差的產(chǎn)生，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。