宣澤義， 曹艷紅， 賈 鵬， 陳少梅， 雷初朝*

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，南寧 530001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

黃牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛。中國黃牛具有廣闊的遺傳基礎(chǔ)和豐富的遺傳變異，起源上包括普通牛(Bostaurus)和瘤牛(Bosindicus)2個(gè)牛種，二者的共同祖先是原牛(Bosprimigenius)。利用位于Y染色體雄性特異區(qū)(MSY)的單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)標(biāo)記可以確定牛的Y染色體單倍型組(即普通牛Y1和Y2單倍型組，瘤牛Y3單倍型組)，對闡明黃牛的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)以及父系起源發(fā)揮了重要作用[1]。

哺乳動物Y染色體由雄性特異區(qū)(MSY)和擬常染色體區(qū)(PAR)兩部分組成，其中MSY區(qū)在減數(shù)分裂時(shí)不與X染色體發(fā)生重組[2-3]，具有父系遺傳特性，突變率低，有完整的單倍型，且不受重組和回復(fù)突變的影響，是研究動物父系起源與遷徙路線的重要工具。根據(jù)Y染色體的形態(tài)特點(diǎn)，可以將中國地方黃牛Y染色體分為3大類：(1)北方黃牛均為中部著絲粒Y染色體，為普通牛起源；(2)南方黃牛均為端部著絲粒Y染色體，屬于瘤牛起源；(3)中原黃牛存在中部和端部著絲粒Y染色體，屬于普通牛與瘤牛的混合起源[4-5]。

隆林黃牛是廣西三大良種黃牛之一，是在喀斯特地貌環(huán)境和植物群落條件下，經(jīng)過長期風(fēng)土馴化、選育形成的廣西優(yōu)良地方黃牛品種，其主要產(chǎn)地為廣西隆林縣、西林縣和田林縣，并于1982年載入《廣西畜牧品種調(diào)查匯編》。隆林黃牛體軀較高大，發(fā)育勻稱，肌肉發(fā)達(dá)，性情溫馴，疾病少，耐粗飼、耐勞、耐熱、耐寒，適應(yīng)性好，肉質(zhì)細(xì)嫩、屠宰率較高、胴體中肌肉比例大，是較理想的役、肉兼用牛，但其存在生長速度緩慢、泌乳量低，以及斜尻、四肢姿勢欠正的缺點(diǎn)[6]。過去選種選配工作落后，致使隆林黃牛某些生產(chǎn)性能出現(xiàn)退化趨勢，近年來為提高隆林牛的各項(xiàng)生產(chǎn)性能，曾引進(jìn)一些外來黃牛品種進(jìn)行雜交。目前關(guān)于隆林黃牛品種Y染色體遺傳多樣性及父系起源的研究較少。本研究利用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)對20頭隆林黃牛公牛進(jìn)行多態(tài)性檢測，通過分析隆林黃牛Y染色體的單倍型組成，來探明該品種的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及父系起源，為開展該品種的分子育種和資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取

在廣西隆林縣隨機(jī)采集20頭隆林黃牛公牛的耳組織樣品，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)酚—氯仿法提取基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

參照Ginja等[7]報(bào)道的2個(gè)家牛Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)合成2對引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μL PCR體系：2×PrimeSTAR Max Premix(上海寶生物公司)12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水10.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸8 min，后冷卻至4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠(含GoldView核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。將檢測合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序分析。

表1 隆林黃牛2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記的PCR片段大小、退火溫度與引物序列

1.3 引物合成和PCR擴(kuò)增

將UTY-19和ZFY-10的測序結(jié)果用Seqman v7.1軟件進(jìn)行對比分析，找出相應(yīng)的SNP位點(diǎn)，并進(jìn)行基因型分型，用ARLEQUIN v3.0軟件計(jì)算單倍型多樣度(H±SD)。

2 結(jié)果與分析

通過對20頭隆林黃牛公牛的2個(gè)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)標(biāo)記的測序分析，UTY-19標(biāo)記分型結(jié)果顯示，隆林黃牛中未發(fā)現(xiàn)C堿基，僅存在A堿基；ZFY-10標(biāo)記分型結(jié)果顯示，隆林黃牛中存在C堿基和T堿基。結(jié)合表2可知，隆林黃牛存在Y2和Y3兩種單倍型組，無Y1單倍型組，即隆林黃牛存在瘤牛和普通牛2個(gè)父系起源。在所檢測的20頭隆林黃牛公牛中有14頭為Y3單倍型組(70%)，有6頭為Y2單倍型組(30%)，單倍型多樣度為0.4421±0.0875。

表2 黃牛Y-SNPs單倍型及起源

3 討 論

父系遺傳的Y-SNPs標(biāo)記分析為研究動物起源、馴化歷史和遷徙路線提供了重要的理論支持。在世界現(xiàn)存的家牛品種中，一共有3種Y染色體單倍型組，分別是普通牛的Y1和Y2單倍型組，瘤牛的Y3單倍型組，Y1單倍型組在歐亞大陸北部分布廣泛，Y2單倍型組主要集中于中東和歐洲南部，而中國黃牛大部分品種都是Y2和Y3單倍型組，只有少部分品種存在Y1單倍型組[8-9]。Li等[10]對16個(gè)中國地方黃牛品種共302頭公牛的4個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(DDX3Y-7、ZFY-9、ZFY-10和UTY-19)和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國黃牛中有極少量個(gè)體含有Y1單倍型組，推測中國黃牛中低頻率的Y1單倍型組可能是由于外來肉牛和奶牛品種的雜交所致，中國地方黃牛品種中原本沒有Y1單倍型組，這是區(qū)分中國地方黃牛品種遺傳資源的一個(gè)重要標(biāo)記。侯佳雯等[11]對皖南牛的父系起源進(jìn)行的相關(guān)研究顯示，皖南牛屬于南方黃牛類型，以瘤牛的種質(zhì)特性為主。李秀良等[12]對潿洲牛2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)及2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)進(jìn)行多態(tài)性檢測，結(jié)果顯示潿洲牛屬于瘤牛父系起源。在本研究中，對隆林黃牛的2個(gè)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)進(jìn)行了父系遺傳分析，結(jié)果顯示，隆林黃牛存在普通牛Y2單倍型組和瘤牛Y3單倍型組兩種單倍型組，且以瘤牛Y3單倍型組為主，表明隆林黃牛是以瘤牛父系起源為主，普通牛父系起源為輔，這與之前在皖南牛和潿洲牛等中國南方黃牛上的研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果顯示，隆林黃牛的單倍型多樣度為0.4421±0.0875，高于國外牛品種的Y染色體單倍型多樣度平均值(0.422±0.3)[13]，這表明隆林黃牛的Y染色體遺傳多樣度相對較高，為隆林黃牛的遺傳資源保護(hù)和利用，及相關(guān)選種選育工作提供了科學(xué)依據(jù)。隆林黃牛是廣西壯族自治區(qū)的重要黃牛品種之一，根據(jù)地域分布屬于南方黃牛即瘤牛類型，由于不斷引進(jìn)中國北方黃牛及國外肉牛品種進(jìn)行雜交，導(dǎo)致隆林黃牛以Y3單倍型組為主，并且存在部分Y2單倍型組，這與中國南方黃牛的起源進(jìn)化和實(shí)際選育情況是一致的。