王婷婷 胡萍 張順利

摘要：研究了內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量和分布的影響，以探討巨噬細胞對胚胎的著床和維持的作用。采用昆明系妊娠小鼠分為對照組和試驗組，在小鼠妊娠6 d（D6）對照組腹腔注射生理鹽水，試驗組分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，分別注射1、2、4 μg劑量的內(nèi)毒素，用酶組織化學染色的方法顯示出子宮內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量和分布。結果顯示，與對照組相比較，試驗Ⅰ、Ⅲ組子宮內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量明顯增多，差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組沒有顯著差異。巨噬細胞在子宮環(huán)肌外層、環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜上的分布與對照組相比較，環(huán)肌外層巨噬細胞數(shù)量減少，而環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜的巨噬細胞數(shù)量明顯增多，差異顯著。提示內(nèi)毒素使妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞數(shù)量增多，細胞向子宮內(nèi)膜遷移，而不利于胚胎著床和維持，可能對母胎免疫耐受產(chǎn)生影響。

關鍵詞：內(nèi)毒素;妊娠小鼠;酶組織化學;巨噬細胞;免疫耐受

中圖分類號：S852.2 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0193-03

妊娠是一個復雜的生理過程，從免疫學上來看類似于器官移植。胚胎對母體來說是一個移植物，母體免疫系統(tǒng)對此進行識別，并產(chǎn)生免疫應答[1]。巨噬細胞是子宮內(nèi)的一種重要免疫細胞，有多種表面標志和標記酶，具有抗感染、抗腫瘤、呈遞抗原和免疫調(diào)節(jié)等作用。巨噬細胞的數(shù)量和在子宮內(nèi)的分布在胚胎的著床和維持中起到一定的作用[2-3]。

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復合物，可刺激機體對多糖成分產(chǎn)生抗體[4]。內(nèi)毒素作為外源性致熱原（熱原質），作用于中性白細胞、單核細胞、巨噬細胞等。內(nèi)毒素能夠激活妊娠小鼠子宮內(nèi)的巨噬細胞，從而對胚胎的著床和維持產(chǎn)生影響[5]，也對母胎免疫耐受產(chǎn)生一定的影響。

本試驗通過給妊娠期小鼠注射不同劑量的內(nèi)毒素，通過酶組織化學染色方法，研究內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞的影響，探討巨噬細胞在胚胎的著床和維持中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物[6] 成年雌性昆明種小鼠40只，由河南師范大學生命科學學院實驗動物繁育中心提供，體質量（25±2） g，自由飲水取食。分成對照組與試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，雌、雄鼠按2 ∶ 1合籠，次日晨查見陰栓者為妊娠1 d，到妊娠6 d（D6）時，對照組腹腔注射生理鹽水，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別注射 1、2、4 μg劑量的內(nèi)毒素，8 d（D8）觀察流產(chǎn)情況并取材。

1.1.2 主要化學藥品和試劑 內(nèi)毒素，購自Sigma公司;α-醋酸萘酯（α-NAE），購自上海試劑一廠;固藍B鹽購自德國Chroma-gesellschaft公司;其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 冰凍切片機（美國Reichert Histo Stat Microtome Cryostat），柯達DC 290數(shù)碼相機。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宮材料的獲取 小鼠脫頸椎處死，沿腹中線剪開腹腔，取其子宮，在預冷的生理鹽水中快速去除脂肪，迅速放入液氮中冷凍30 s。標記好材料放入-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 冰凍切片的制備 -20 ℃下冰水包埋材料，修塊，切片，切片的厚度8 μm，材料平鋪在載玻片上，涼干后-20 ℃冰箱冷凍保藏。

1.2.3 0.2 mol/L PBS鹽溶液配制 A液：NaH2PO4·2H2O 3.12 g加100 mL蒸餾水;B液：Na2HPO4·12H2O 7.16 g加100 mL蒸餾水;取A液13 mL加B液87 mL，混合均勻，調(diào)pH值至7.4。

1.2.4 孵育液配制 0.03 g α-醋酸萘酯+5 mL丙酮充分溶解+5 mL蒸餾水混勻+20 mL PBS鹽溶液（要邊加邊搖晃防止生成沉淀）+固藍B鹽。充分攪拌溶解混勻。注意孵育液要即配即用。

1.2.5 酶組織化學染色 （1）把冰凍切片室溫下充分干燥。（2）放入純丙酮液中固定10 min。（3）取出固定好的切片用0.2 mol/L的PBS鹽溶液沖洗3次，每次5 min。（4）把沖洗好的切片放入配制好的孵育液中，37 ℃溫浴鍋孵育50 min。（5）從孵育液中取出切片，用0.2 mol/L PBS鹽溶液沖洗1次，5 min。放入0.2 mol/L PBS鹽溶液中浸泡5 min，再放入蒸餾水中浸泡2 min，取出后甘油明膠封片。（6）鏡檢、拍照、統(tǒng)計分析。

1.2.6 統(tǒng)計方法 采用χ2檢驗，α=0.05，結果大于α差異不顯著，小于α差異顯著。2 結果與分析

2.1 酶組織化學染色巨噬細胞的結果

鏡檢觀察子宮內(nèi)巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞多為不規(guī)則形狀，也有呈橢圓形、圓形的，染色結果細胞質呈紫色，而細胞核為無色（圖1）。

2.2 內(nèi)毒素對妊娠小鼠胚胎著床的影響

正常小鼠的胚胎為粉紅色，透明度較高。注射內(nèi)毒素后能誘使胚胎流產(chǎn)，先出現(xiàn)陰道出血，然后出現(xiàn)胚胎吸收。對照組未觀察到流產(chǎn)，胚胎為粉紅色;試驗Ⅰ組小鼠未見流產(chǎn)，但發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)有黑紅色的瘀血;試驗Ⅱ、Ⅲ組流產(chǎn)率分別為75%和100%，胚胎已經(jīng)模糊不清，出現(xiàn)吸收現(xiàn)象（表1）。

2.3 內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞數(shù)量的影響

注射不同劑量的內(nèi)毒素使妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞的總數(shù)呈波動性變化，注射1 μg內(nèi)毒素巨噬細胞數(shù)量較正常對照組明顯增加，2 μg時數(shù)量又下降到正常水平，4 μg時數(shù)量又增加（圖2）。

妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞的總體數(shù)量變化，試驗Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組相比差異不顯著（表2）。

2.4 內(nèi)毒素對妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞分布的影響

妊娠小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細胞數(shù)量分布的變化，試驗Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組相比差異不顯著（表3）。

妊娠小鼠子宮內(nèi)環(huán)肌層巨噬細胞的數(shù)量分布變化，試驗Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組相比差異顯著（表4）。

妊娠小鼠子宮內(nèi)環(huán)肌外層巨噬細胞的數(shù)量分布變化，試驗Ⅰ、Ⅲ組與對照組相比差異極顯著，而試驗Ⅱ組與對照組相比差異顯著（表5）。

注射不同劑量的內(nèi)毒素使妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量分布發(fā)生變化。隨著注射內(nèi)毒素劑量的逐漸增加，環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜的細胞數(shù)量增加， 環(huán)肌外層細胞數(shù)量減少。正常情況下，巨噬細胞大多數(shù)分布于子宮外膜，注射內(nèi)毒素刺激環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜的巨噬細胞數(shù)量增加。雖然試驗Ⅱ組妊娠小鼠子宮內(nèi)巨噬細胞總數(shù)量沒有變化，但巨噬細胞在子宮內(nèi)的分布與對照組相比環(huán)肌內(nèi)層的數(shù)量明顯增多（圖3）。

3 討論

文獻報道非特異性酯酶α-NAE存在于單核細胞、粒細胞系統(tǒng)中，而子宮內(nèi)的其他細胞幾乎不含此物質[7]，本研究觀察子宮內(nèi)巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞多為不規(guī)則形狀，也有呈橢圓形、梭形。α-NAE主要存在于巨噬細胞的細胞質內(nèi)，染色結果細胞質呈紫色，而細胞核為無色。用此方法可以很簡便很快速地顯示陽性巨噬細胞，與組化染色相比很經(jīng)濟，但也有一定的缺點，比如染色很容易褪色、不易長時間保存。

有文獻報道在妊娠期D8肌層中幾乎沒有巨噬細胞[8]，本研究也觀察到相同的結果，所以在對巨噬細胞進行統(tǒng)計計數(shù)時把子宮結構分為環(huán)肌外層、環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜進行統(tǒng)計分析。

研究發(fā)現(xiàn)，1 μg內(nèi)毒素能使小鼠巨噬細胞數(shù)量增加，使小鼠子宮內(nèi)膜、肌層的巨噬細胞都與對照有顯著性差異，但是隨著內(nèi)毒素劑量的增加，到2 μg時，子宮總的巨噬細胞基本沒有變化，但是肌層巨噬細胞和對照相比有了顯著性差異。4 μg 時，全部的孕鼠均發(fā)生了流產(chǎn)，但總的子宮巨噬細胞數(shù)量和1 μg沒有顯著性差異。但是同樣，流產(chǎn)小鼠子宮內(nèi)膜和肌層的巨噬細胞都與對照有顯著性差異。由此，推測子宮內(nèi)巨噬細胞數(shù)量的多少和LPS的用量有關。在一定的LPS范圍內(nèi)，巨噬細胞的數(shù)量隨LPS劑量增加而減少到一定水平，但是當LPS量繼續(xù)增大時，巨噬細胞的數(shù)量將會增多。

小鼠在正常妊娠期間子宮內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量分布隨時間不斷地發(fā)生動態(tài)變化，在小鼠妊娠D8子宮內(nèi)的巨噬細胞主要集中在子宮的環(huán)肌外層，而環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜中幾乎沒有巨噬細胞，有利于胚胎著床和維持。妊娠期子宮內(nèi)巨噬細胞過多存在對于妊娠不利[9]。本研究也觀察到了這種現(xiàn)象，但是試驗還觀察到了2 μg劑量巨噬細胞總數(shù)基本沒有變化，但是在子宮內(nèi)部的分布卻發(fā)生了變化，也就是說巨噬細胞在子宮內(nèi)發(fā)生了遷移，從而導致流產(chǎn)。

但內(nèi)毒素是如何調(diào)節(jié)巨噬細胞的遷移呢？試驗組與對照組相比巨噬細胞的數(shù)量明顯增加，而且巨噬細胞在子宮環(huán)肌內(nèi)層和內(nèi)膜的分布數(shù)量也明顯增加，試驗Ⅱ組雖然巨噬細胞數(shù)量又降到正常的水平，但巨噬細胞分布在環(huán)肌內(nèi)層的數(shù)量也明顯增加。

內(nèi)毒素并不干擾孕鼠的正常內(nèi)分泌功能，也不能穿越胎盤進入胎兒體內(nèi)。內(nèi)毒素誘導流產(chǎn)的一個重要機制是引起預致敏的（primed）巨噬細胞釋放TNF-α[10-12]。TNF-α導致流產(chǎn)已被動物試驗所證實，內(nèi)毒素誘導小鼠流產(chǎn)與子宮內(nèi)TNF-α的產(chǎn)生有直接關系，本試驗中內(nèi)毒素能誘導巨噬細胞由子宮外膜向子宮內(nèi)膜發(fā)生遷移，使子宮內(nèi)膜巨噬細胞數(shù)量增加，推測遷移到內(nèi)膜的巨噬細胞釋放TNF-α。它可直接引起胎盤滋養(yǎng)層細胞的凋亡，因滋養(yǎng)層前祖細胞在未成熟階段發(fā)生程序性死亡而耗竭，導致子宮內(nèi)胎兒缺乏營養(yǎng)而死亡[13]。使妊娠小鼠子宮內(nèi)的胚胎不能正常著床和維持，可能不利于母胎免疫耐受，使母鼠對胚胎產(chǎn)生排斥而流產(chǎn)，所以內(nèi)毒素能激活巨噬細胞，使巨噬細胞數(shù)量增加，并誘導巨噬細胞向子宮內(nèi)發(fā)生遷移，影響胚胎的著床和維持，導致妊娠小鼠流產(chǎn)。

參考文獻：

[1]郝蘇平. 中藥對動物噪音應激誘導流產(chǎn)的安胎作用及機理[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2012.

[2]Baines M G，Duclos A J，Antecka E，et al. Decidual infiltration and activation of macrophages leads to early embryo loss[J]. American Journal of Reproductive Immunology，1997，37（6）：471-477.

[3]肖云山，林其德. 妊娠早期蛻膜組織巨噬細胞分泌IL-10/IFN-γ功能的特征[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2005，14（3）：218-221.

[4]張喜平，周田美，董曉勤，等. 黃芩苷注射液體外抗菌作用實驗研究[J]. 醫(yī)學研究雜志，2006（8）：39-41.

[5]鐘秀會，周占祥，孫秉貴，等. 黃芩白術對LPS誘導小鼠流產(chǎn)的對抗作用及子宮內(nèi)IL-2含量的影響[J]. 中國獸醫(yī)雜志，1999，25（2）：51-53.

[6]閆 坤. 前列腺素E1對小鼠子宮巨噬細胞表型和功能活性的影響[D]. 河南師范大學，2011.

[7]王永才. 血液骨髓細胞檢查[M]. 大連科技文獻出版社，1994.

[8]周占祥，鄧澤沛，孫秉貴，等. 生殖周期中小鼠子宮巨噬細胞的分布[J]. 解剖學報，1998，29（2）：96-101.

[9]田興輝，鄧澤沛，鐘秀會，等. 孕酮拮抗物RU486對妊娠小鼠子宮巨噬細胞的影響及與妊娠相關性的研究[J]. 解剖學報，2002，33（1）：97-101.

[10]張 青，徐劍鋮，毛寶齡，等. 內(nèi)毒素致傷大鼠肺組織TNF-α、?IL-6的mRNA表達及TNF-α、IL-6活化研究[J]. 中國危重病急救醫(yī)學，2001，13（9）：523-526.

[11]Blackwell T S，Blackwell T R，Christman J W. Induction of endotoxin tolerance depletes nuclear factor-κB and suppresses its activation in rat alveolar macrophages[J]. Leukoc Biol，1997，62（6）：855-861.

[12]錢志英，劉亞潔. 水紅花子對LPS誘導流產(chǎn)小鼠子宮巨噬細胞的抑制效應及其保胎作用[J]. 中國免疫學雜志，2014（6）：763-767.

[13]Yui J，Garcia-Lloret M，Wegmann T G，et al. Cytotoxity of tumour necrosis factor-alpha and gamm-interferon against primary human placental trophoblasts[J]. Placenta，1994，15（8）：819-826.