王姣龍,諶小勇,2,4,閆文德,2,3,*

1 中南林業(yè)科技大學(xué),長(zhǎng)沙 410004 2 南方林業(yè)生態(tài)應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410004 3 城市森林生態(tài)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410004 4州長(zhǎng)州立大學(xué),伊利諾伊州 IL 60484

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的具有致癌、致畸、致突變性的持久性有機(jī)污染物,主要來源于人類活動(dòng),例如汽車尾氣、化石燃料不完全燃燒等[1],可通過大氣、水體、土壤和植物間的傳輸和交換而在整個(gè)環(huán)境中分布,并經(jīng)過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體和人體,直接威脅包括人類在內(nèi)的生命有機(jī)體的健康和安全[2]。因此,揭示PAHs在環(huán)境中的動(dòng)態(tài)機(jī)制,加快對(duì)PAHs的清除速度,對(duì)于環(huán)境質(zhì)量改善和國(guó)土安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

添加模擬根系分泌物是一項(xiàng)很有發(fā)展前途的新型的PAHs污染土壤的生物修復(fù)技術(shù),其原理是通過調(diào)節(jié)和改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和活性促進(jìn)PAHs的降解[3]。微生物降解土壤中的PAHs一般有兩種方式,一種是以PAHs為唯一碳源和能源；另一種是將PAHs與其他有機(jī)質(zhì)進(jìn)行共代謝作用。據(jù)報(bào)道[4],根系分泌物中的一些低分子有機(jī)酸,比如琥珀酸和蘋果酸能夠有效促進(jìn)吸附在土壤上的菲和芘的解吸,提高土壤中PAHs的有效性,從而加快PAHs的降解。土壤中有機(jī)質(zhì)含量越低,解吸作用越明顯。且不同分子量的外加碳源組分均在一定程度上縮短細(xì)菌對(duì)芘進(jìn)入快速降解期的時(shí)間[5]。不同低分子有機(jī)酸對(duì)PAHs降解的影響作用不同,Wei等[6]發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)下,丁酸對(duì)混合PAHs(芴、菲、芘)降解效果優(yōu)于蘋果酸和檸檬酸,其主要是極性較弱的丁酸可優(yōu)化表面疏水性較強(qiáng)的分支桿菌與疏水性PAHs的接觸。

在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn),植物根系分泌物種類繁多。在PAHs脅迫下,根系分泌物中的物質(zhì)組成發(fā)生改變[7-8]。作為利用植物根系分泌物對(duì)PAHs污染土壤修復(fù)技術(shù)研究項(xiàng)目的一部分,本研究通過高通量Illumina Miseq技術(shù),重點(diǎn)研究根系分泌物中低分子有機(jī)酸對(duì)土壤中菲的降解過程,并探討添加低分子有機(jī)酸后菲污染土壤中細(xì)菌群落種類和數(shù)量的變化特征,揭示植物根系分泌物對(duì)PAHs污染土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,以期為進(jìn)一步研發(fā)PAHs污染環(huán)境下的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自于中南林業(yè)科技大學(xué)校園東園苗圃表層土壤(0—20 cm)。將供試土壤撿出根系、石塊等殘留物,自然風(fēng)干后過2 mm篩子。采用酸度計(jì)測(cè)定土壤的 pH 值(水土比 5∶1)；采用島津總有機(jī)碳測(cè)定儀測(cè)定土壤總有機(jī)碳含量,采用凱氏蒸餾法測(cè)定土壤全N含量,采用硫酸-高氯酸消煮法測(cè)定土壤全P含量。經(jīng)測(cè)定,供試土壤的基本理化性質(zhì)：土壤pH值為5.40,土壤總有機(jī)碳含量為5.02 g/kg,土壤全N含量為0.13 g/kg,土壤全P含量為0.22 g/kg。

菲污染土壤的制備：選用菲(>97%,購(gòu)于Sigma-Aldrich Co.)作為供試污染源,菲是PAHs中3個(gè)苯環(huán)的代表物,在環(huán)境中廣泛存在,是檢測(cè)PAH污染的指示物。將菲溶于丙酮后倒入供試土壤中均勻混合,制得2000 mg/kg水平的菲污染土壤,置于盆缽中平衡7 d后備用。

取500 g菲污染土壤盛裝于500 mL燒杯中,燒杯外壁裹上錫箔紙,模擬土壤黑暗狀態(tài),分別加入30 mL 0.16 mol/L乙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、混合有機(jī)酸(乙酸、檸檬酸、酒石酸及草酸的混合液)溶液,攪拌均勻后放置在溫室中,貼好標(biāo)簽。同時(shí)設(shè)置對(duì)照處理,即在500 g污染土壤的燒杯中加入30 mL的去離子水,形成6種不同的處理：對(duì)照處理(K)、乙酸處理(Y)、檸檬酸處理(N)、酒石酸處理(J)、草酸處理(C)、混合有機(jī)酸處理(H)。每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)180 d,實(shí)驗(yàn)期間燒杯隨意擺放,每月將燒杯位置隨機(jī)移動(dòng)一次,盡量使每個(gè)燒杯的微環(huán)境保持一致,室內(nèi)溫度因開窗對(duì)流基本與環(huán)境溫度保持一致。實(shí)驗(yàn)分別于0、60、90、180 d后,采樣。

1.2 研究方法

土壤中菲的提取和凈化：取5 g制備好的土壤樣品于聚乙烯杯中,加入50 mL甲醇后,震蕩5 min,超聲20 min,4000 r/min離心25 min,取上清液過0.45 μm孔徑聚丙烯纖維濾膜,將稀釋液過SPE萃取柱,10 mL乙腈洗脫,取1 mL洗脫液過0.45 μm孔徑濾膜后上氣質(zhì)聯(lián)用儀分析。

氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定條件：流量1 mL/min,進(jìn)樣口溫度230 ℃,接口溫度280,60 ℃→15 ℃/min→100 ℃(5 min)→8 ℃/min→210 ℃(3 min)→2 ℃/min→290 ℃(5 min)。

色譜柱為HP- 5毛細(xì)管色譜柱30 m×0.25 mm。不分流進(jìn)樣,氣化溫度280 ℃,載氣為高純He。

細(xì)菌16S rRNA 基因高通量測(cè)序[9]：測(cè)序由上海美吉生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成,采用Illlumina Miseq系統(tǒng)進(jìn)行雙向測(cè)序,采用引物515 F和907 R擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因片段。測(cè)序所得結(jié)果,采用prinseq軟件對(duì)reads1、reads2的3端進(jìn)行質(zhì)控,截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù),以提高后續(xù)序列融合比率。通過Flash 軟件融合雙末端序列,使其形成一條序列。采用prinseq軟件對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行去引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列、低質(zhì)量序列。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)輸入整理及作圖采用Excel 2010軟件；采用SPSS 18.0對(duì)土壤理化數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較,使用R語(yǔ)言分析微生物多樣性數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下土壤中菲的降解過程

圖1 不同處理水平下土壤中菲降解Fig.1 Degradation of Phenanthrene in soil at different levels

由圖1可知,隨著時(shí)間的推移,對(duì)照組土壤中菲會(huì)自然降解,添加低分子有機(jī)酸對(duì)土壤中菲的降解有一定的促進(jìn)作用,第0天土壤中菲含量均為571.46 mg/kg,第60天,菲含量降到了：210.70—340.39 mg/kg,降解率為：乙酸(63.13%)>檸檬酸(49.30%)>草酸(49.27%)>酒石酸(49.13%)>混合有機(jī)酸(43.28%)>對(duì)照(40.44%)；第90天,菲含量為：208.65—321.55mg/kg,降解率為：乙酸(63.49%)>檸檬酸(53.96%)>混合有機(jī)酸(51.83%)>草酸(51.72%)>酒石酸(50.45%)>對(duì)照(43.73%)。第180天,菲含量為：175.28—306.07 mg/kg,降解率分別為：乙酸(69.33%)>混合有機(jī)酸(57.41%)>草酸(56.15%)>檸檬酸(54.98%)>酒石酸(52.30%)>對(duì)照(46.44%)。用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)不同處理下菲降解過程進(jìn)行了擬合(表1),結(jié)果表明,相較于對(duì)照,添加低分子有機(jī)酸的組分動(dòng)力學(xué)常數(shù)增大,半衰期縮短,由動(dòng)力學(xué)常數(shù)得出乙酸對(duì)菲降解的促進(jìn)作用最為明顯。

表1 不同處理水平下菲的一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程

K：對(duì)照，Y：添加乙酸，N：添加檸檬酸，J：添加酒石酸，C：添加草酸，H：添加混合有機(jī)酸

2.2 菌群群落結(jié)構(gòu)組成

18個(gè)土壤樣品中細(xì)菌分布在12個(gè)門,24個(gè)綱,42個(gè)目,50個(gè)科,61個(gè)屬,61個(gè)種。序列中不能識(shí)別的分在其他組中。

在門分類水平下(圖2示),6個(gè)處理中,變形菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、裝甲菌門、GAL15、硝化螺旋菌門、Latescibacteria為優(yōu)勢(shì)門類,豐度占比90%以上。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門,包括了假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等多種環(huán)芳烴降解菌屬,所有處理中變形菌門豐度均為最大,占所有組細(xì)菌門類的70.39%,添加低分子有機(jī)酸的組分中變形菌門豐度明顯高于對(duì)照組,其中乙酸組變形菌門豐度占比在第60天(71.57%)和第180天(93.46%)時(shí)最大,混合有機(jī)酸占比在第90天(93.7%)時(shí)最大(圖3示)。

圖2 門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.2 Bacteria community structure and distribution at phylum levelK：對(duì)照，Y：添加乙酸，N：添加檸檬酸，J：添加酒石酸，C：添加草酸，H：添加混合有機(jī)酸

圖3 不同時(shí)期變形菌門豐度分布圖 Fig.3 Distribution of Proteobacteria abundance at different stages

在屬分類水平下(圖4示),6個(gè)處理中,產(chǎn)黃桿菌屬(Rhodanobacter)、Fimicutes、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Amatimonadetes、GAL15為優(yōu)勢(shì)菌屬,豐度占比90%以上。以豐度占比最大的產(chǎn)黃桿菌屬為例,產(chǎn)黃桿菌屬具有一定的多環(huán)芳烴降解能力[10],添加低分子有機(jī)酸的組分中產(chǎn)黃桿菌屬豐度明顯高于對(duì)照組(圖4示),第60天時(shí)檸檬酸組豐度占比(30.69%)最大,第90天時(shí)酒石酸組最大(49.37%),第180天時(shí)乙酸組最大(41.22%)。在第60天、第90天及第180天還檢測(cè)到了5種典型的菲降解菌,分別為：Bacillus[11]、鞘氨醇單胞菌屬[12]、Massilia[13]、Azospirillum[14]、Burkholderia-paraburkholderia[15]。5種典型菲降解菌均呈現(xiàn)出添加低分子有機(jī)酸組豐度占比高于對(duì)照組,且隨時(shí)間推移豐度占比升高。在第60天和第180天檢測(cè)到了一種PAHs降解菌紅球菌[11]。

2.3 菌群豐度變化和多樣性分析

OTU數(shù)是通過聚類操作得到的具有相似性的序列小組,可代表物種數(shù)目。由表2知,共檢測(cè)到648795條有效序列和565127個(gè)OTU。不同處理之間,OTU數(shù)量存在較大差異,第60天,對(duì)照組中OTU數(shù)明顯高于其他組,排序?yàn)閷?duì)照>混合有機(jī)酸>乙酸>草酸>酒石酸>檸檬酸；第90天,排序?yàn)椋翰菟?檸檬酸>對(duì)照>乙酸>酒石酸>混合有機(jī)酸；第180天,對(duì)照>乙酸>混合有機(jī)酸>檸檬酸>草酸>酒石酸。不同采樣時(shí)間之間也存在差異,隨著時(shí)間推移土壤中總OTU數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),分別為：60天(OTU總數(shù)為197084)>90天(184663)>180天(183380)。

表2 不同處理水平下的測(cè)序結(jié)果和豐度變化

對(duì)不同處理水平下的土壤進(jìn)行Alaha多樣性分析,用Ace指數(shù)和Chao指數(shù)表示土壤中菌群豐度水平,用香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)表示菌群多樣性。結(jié)果顯示,在第60天、第90天和第180天,Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均呈現(xiàn)出對(duì)照組菌群豐度水平高于其他添酸組,香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)也顯示出對(duì)照組菌群多樣性高于其他添酸組,這說明添加低分子有機(jī)酸降低了菲污染土壤中細(xì)菌豐度及多樣性。在添加了低分子有機(jī)酸的組分中,第60天和第90天時(shí)酒石酸組細(xì)菌豐度及多樣性較高,第180天時(shí)混合有機(jī)酸組較高。

圖4 屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.4 Bacteria community structure and distribution at genus level

圖5 不同時(shí)期產(chǎn)黃桿菌屬豐度分布圖Fig.5 Distribution of Rhodanobacter abundance at different stages

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)的方法鑒別不同處理中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。由圖6示,在OTU水平下進(jìn)行了主成分分析,在第60、90、180天,對(duì)照組與其他添加低分子有機(jī)酸的組分相關(guān)性不明顯。在第180天,添加草酸和檸檬酸組中OTU組成高度相似。其余不同時(shí)期不同組分之間相似度不高。

圖6 細(xì)菌群落的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of bacterial community

2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析

由圖7示,用Venn圖來表示不同時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性。第60天、第90天、第180天測(cè)得的OTU種類數(shù)分別為：2680、2705、2542；其中共有OTU種類(1911),占3個(gè)時(shí)期總OTU種類數(shù)(3370)的56.71%；第60天、第90天、第180天獨(dú)有的OTU數(shù)分別為233(占總OTU種類數(shù)比例為6.91%)、292(8.66%)、199(5.91%)。第60天、第90天、第180天測(cè)得的屬種類分別為：530、560、540；其中共有屬種類(446),占3個(gè)時(shí)期總屬種類數(shù)(656)的67.99%,獨(dú)有的屬數(shù)分別為26(占總屬種類數(shù)比例為3.96%)、66(10.06%)、36(5.49%)。第60天、第90天、第180天測(cè)得的門種類分別為：31、33、28；其中共有門的種類(28),占3個(gè)時(shí)期總門種類數(shù)(35)的80.00%,獨(dú)有的門數(shù)分別為2(占總門種類數(shù)比例為5.71%)、4(11.42%)、0(0.00)。在門水平、屬水平和OUT水平下,第60天至第180天之間獨(dú)有種類數(shù)均呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì),說明了不同處理之間在第90天時(shí)細(xì)菌菌群差異性最大。

圖7 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的Venn圖Fig.7 Venn drawing of bacterial community structure

3 討論與結(jié)論

目前,利用植物-微生物復(fù)合體系降解多環(huán)芳烴污染物已有一些報(bào)道[16],但植物根系分泌物對(duì)植物-微生物復(fù)合體系降解多環(huán)芳烴的影響研究較少。本研究驗(yàn)證了添加根系分泌物促進(jìn)了菲的降解,通過研究土壤中細(xì)菌群落特征,深入分析了根系分泌物降解菲的機(jī)理,為PAHs污染修復(fù)提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

菲污染土壤自身有一定的修復(fù)能力,但低分子有機(jī)酸對(duì)于土壤中菲的降解有明顯的促進(jìn)作用。低分子有機(jī)酸促進(jìn)土壤中多環(huán)芳烴的降解主要因?yàn)樘峁┝颂荚创龠M(jìn)了多環(huán)芳烴降解菌的生長(zhǎng),不同低分子有機(jī)酸提供的碳含量存在差異,超過一定濃度時(shí)會(huì)對(duì)土壤中的微生物產(chǎn)生抑制作用[17],因此不同低分子有機(jī)酸對(duì)多環(huán)芳烴降解的促進(jìn)作用不同。本研究中,通過計(jì)算一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程得出乙酸組對(duì)菲降解的促進(jìn)作用強(qiáng)于其他組分,乙酸有應(yīng)用于土壤修復(fù)治理的潛力,這可能是由于菲降解菌對(duì)不同種類低分子有機(jī)酸利用率不同,也可能由于不同種類低分子有機(jī)酸對(duì)土壤理化性質(zhì)影響存在差異,添加低分子有機(jī)酸會(huì)導(dǎo)致土壤pH值降低,影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu),具體原因有待進(jìn)一步分析。

通過高通量Illumina Miseq技術(shù)綜合評(píng)價(jià)了土壤細(xì)菌群落特征,得出從細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)來看,土壤細(xì)菌的數(shù)量及其多樣性或許不是導(dǎo)致土壤菲降解的主要因素,反而特定的菲降解菌的豐度對(duì)菲降解有重要影響。這有可能是低分子有機(jī)酸僅為土壤中某些特定的微生物群落提供了碳源,促進(jìn)了特定微生物的增長(zhǎng),并不一定會(huì)增加微生物總量及多樣性。王悅等[18]研究了三葉草根系分泌物對(duì)多環(huán)芳烴微生物降解及加氧酶的影響,得出三葉草根系分泌物促進(jìn)了分枝桿菌M1加氧酶基因拷貝數(shù)的增長(zhǎng),卻未明顯引起16S rDNA基因數(shù)的增加。這說明了微生物數(shù)量及多樣性并不是反映微生物降解多環(huán)芳烴能力的敏感指標(biāo)。添酸組中變形菌門豐度明顯高于對(duì)照組,且檢測(cè)到的5種典型的菲降解菌(分別為：Bacillus[11]、鞘氨醇單胞菌屬[12]、Massilia[13]、Azospirillum[14]、Burkholderia-paraburkholderia[15])的豐度占比在添酸組中明顯高于對(duì)照組,通過PCA分析也證明了對(duì)照組和其他添酸組的細(xì)菌菌群存在差異性?？赡苁且?yàn)榉平到饩S度的增加促進(jìn)了菲的降解,也可能與土壤理化性質(zhì)有關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

添加低分子有機(jī)酸處理下不同時(shí)期土壤中細(xì)菌存在差異,隨著時(shí)間推移土壤中總OTU數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),有可能是土壤中碳源隨時(shí)間減少,造成了土壤中OTU總數(shù)的減少。根據(jù)共代謝(Cometabolism)作用原理,也有可能是低分子有機(jī)酸的存在,增強(qiáng)了菲降解菌的酶活性,提高了菲降解菌對(duì)非生長(zhǎng)基的降解效率。從細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Venn圖可以看出,添加低分子有機(jī)酸影響了PAHs污染土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成,在第90天時(shí)細(xì)菌菌群差異性最大,這與眾多學(xué)者的研究結(jié)果一致[19-20],說明隨著時(shí)間推移,土壤中菲含量下降,引起了細(xì)菌多樣性先增長(zhǎng)后下降的改變[21-22]。