王戰(zhàn)偉 徐煒 邵霞 張明 王曉紅 丁耘峰

湖州市中心醫(yī)院（浙江湖州313000）

目前全球范圍內(nèi)在女性惡性腫瘤中乳腺癌的發(fā)病率及病死率均排在第1 位［1］。乳腺癌具有較強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，特別易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，盡管經(jīng)過規(guī)范的綜合治療，但仍然有相當部分乳腺癌患者出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移。而PD-L1（programmed cell death ligation 1）在介導腫瘤免疫逃避中有重要作用［2］，且PD-L1/PD-1 信號通路作為免疫治療的靶點在非小細胞肺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤治療中取得了不錯的效果［3］。因此研究乳腺癌中PD-L1 蛋白的表達情況可以為乳腺癌患者是否可采取免疫治療提供理論依據(jù)。本研究采用免疫組織化學法研究PD-L1 蛋白在乳腺癌及其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達情況，探討PD-L1 蛋白的表達與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的相關關系，并分析PD-L1 蛋白表達水平與乳腺癌患者細胞免疫的相關性，旨在為乳腺癌的免疫治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究所用標本均來自湖州市中心醫(yī)院乳腺外科2017年10月至2018年5月因乳癌行改良根治術的76 例患者。所有患者術前未行新輔助治療，年齡29 ～84（53.1 ± 8.9）歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28 例。所有病例臨床病理分期根據(jù)AJCC（第八版）乳腺癌TNM 分期：Ⅰ期31 例，Ⅱ期33 例，Ⅲ期12 例。

1.2 檢測方法采用SP 三步法免疫組化染色。主要試劑：小鼠抗人PD-L1（Proteintech 公司，美國，克隆號：2B11D11）、羊抗小鼠二抗、山羊血清、DAB 顯色劑、過氧化氫封閉液等購自（北京中杉金橋生物技術有限公司）。石蠟標本行3 μm 厚連續(xù)切片，先后予二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS 緩沖液洗3 次（每次5 min 下同），抗原修復液及微波熱抗原修復（中低火力15 min），PBS 緩沖液洗3次，3%過氧化氫封閉液室溫孵育10 min 抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS 緩沖液洗3 次，去除PBS 液后，滴加50 μL 的山羊血清，37 ℃恒溫箱孵育20 min 或者室溫孵育0.5 h，去除血清后加小鼠抗人PD-L1（稀釋濃度為1∶40，陰性對照用抗體稀釋液代替一抗），4 ℃冰箱冷藏過夜，PBS 緩沖液洗3 次，加羊抗小鼠二抗37 ℃恒溫箱孵育30 min 后PBS 緩沖液洗3 次，DAB 著色，蘇木素核染，脫水、干燥，封片。

1.3 鏡下檢查免疫組化結(jié)果判讀由2 位病理科醫(yī)師完成。細胞核被染成藍色或淡藍色，細胞質(zhì)或細胞膜有淡黃色、棕黃色或者褐色顆粒的細胞為陽性表達，相反細胞膜及細胞質(zhì)無著色為陰性表達。每張切片在×200 倍鏡下隨機選擇5 個腫瘤區(qū)域進行細胞計數(shù)。參照Fromowitz 等標準按半定量分級法判定免疫組化染色結(jié)果，具體評分細則如下：（1）未著色0 分，淡黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分；（2）陽性范圍：＜5%為0 分，5% ～25%為1 分，26% ～50%為2 分，51% ～75%為3 分，＞75%為4 分。上述兩項結(jié)果相加分值若＜2 分判為陰性（-），2 ～3 分為弱陽性（+），4 ～5 分為中度陽性（++），6 ～7 分為強陽性（+++）；結(jié)果≥2 分為陽性組，＜2 分為陰性組。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 15.0 行統(tǒng)計分析，PD-L1 蛋白在乳腺癌組織中的表達率與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關性分析采用χ2或Fisher 確切概率法來檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1 在乳腺癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達情況PD-L1 蛋白主要表達于細胞質(zhì)和細胞膜，呈棕黃色顆?；蚝贮S色粗顆粒（圖1）；76 例乳癌原發(fā)灶標本中有陽性表達19 例（陽性率25.0%）；PD-L1 在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中陽性表達（圖2），28 例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中PD-L1 呈陽性表達的有6 例（陽性率21.4%），其中57 例原發(fā)灶陰性的樣本中有1 例轉(zhuǎn)移灶陽性表達，19 例原發(fā)灶陽性表達的樣本中5 例轉(zhuǎn)移灶呈陽性表達。

2.2 PD-L1 對的表達與患者臨床病理資料之間的關系經(jīng)χ2檢驗得出：乳癌原發(fā)灶PD-L1 蛋白表達陽性率僅與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、ER 及Her2 的表達有關，P值分別為0.006、0.040 、0.041、0.014，均P＜0.05（表1）。

圖1 乳腺癌原發(fā)灶細胞膜和細胞質(zhì)PD-L1 染色陽性Fig.1 The positive expression of PD-L1 in primary breast cancer cell membrane

圖2 乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中PD-L1 的陽性表達Fig.2 The positive expression of PD-L1 in metastatic lymph nodes of breast cancer

3 討論

PD-L1 是第3 個被發(fā)現(xiàn)的B7 家族成員，也被稱為B7-H1（B7 homolog 1），或者CD274，屬于共抑制分子，主要表達在細胞質(zhì)及細胞膜上，且受到多種細胞因子及腫瘤抗原的調(diào)節(jié)。目前腫瘤細胞免疫逃逸被認為是癌癥形成的機理之一，而PD-L1/PD-1 信號通路在該過程中起到重要的作用，其參與調(diào)節(jié)人體細胞及體液免疫，尤其是細胞免疫［4］。PD-L1 能與位于T 細胞表面的受體PD-1 結(jié)合傳遞抑制信號，導致T 細胞發(fā)生凋亡、失活，從而介導腫瘤免疫逃逸［2］。研究［5-7］報道PD-L1 蛋白在肺癌、黑色素瘤、胃癌、腸癌等多種實體腫瘤中呈高表達，且其表達水平與患者的臨床病理參數(shù)及預后密切相關。

本研究結(jié)果顯示PD-L1 表達于乳腺癌組織的細胞膜和細胞質(zhì)中，19 例PD-L1 陽性表達，陽性率25.0%。目前因PD-L1 抗體型號及判讀標準不同，各研究報道的陽性率差異較大，且如何定義PD-L1在細胞表達的陽性部位也有待進一步的研究［8］。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1 的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關，PD-L1 陽性乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，TNM 分期高。這可能與腫瘤細胞上高表達的PD-L1，通過與PD-1 受體結(jié)合，傳遞抑制信通過多種機制包括激活T 細胞凋亡、抑制穿孔素的產(chǎn)生、抑制細胞毒性T 細胞介導的細胞溶解作用等導致乳癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更易發(fā)生，從而有更高的腫瘤分期與較差預后［9］。同時本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1 的表達與Her2 的過表達相關，Her2 陽性乳腺癌中的PD-L1 的表達率明顯高于Her2 陰性者。對乳腺癌分子亞型的生存分析發(fā)現(xiàn)，在Luminal B 型、Her2過表達型、基底樣型等各分子亞型乳腺癌中PD-L1高表達與較短的OS 相關［10］，且在Her2 陽性乳腺癌中，PD-L1 高表達是一個獨立的不良預后指標［11］。這說明在乳腺癌中PD-L1 高表達可能預示不良預后。阻斷PD-1/PD-L1 途徑的治療已經(jīng)成為癌癥免疫治療的焦點，研究報道針對晚期腎細胞癌的臨床試驗中，聯(lián)合免疫治療組較單用靶向組在療效方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢［12］。因此關于乳腺癌的免疫治療研究有廣闊的前景。另外，本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞PD-L1 的表達存在不一致。筆者認為這種異質(zhì)性表明了PD-L1 表達的動態(tài)性［13］，這可能為研究轉(zhuǎn)移性乳腺癌的抗PD-L1 治療提供新的方向。

表1 乳腺癌組織中PD-L1 的表達與臨床病理特征的關系Tab.1 The relationship between the PD-L1 protein expression rates and clinicopathological features in breast cancer

PD-L1 介導的腫瘤免疫逃避導致腫瘤更易發(fā)生轉(zhuǎn)移且預后較差。因此可將PD-L1 做為評判乳腺癌患者預后的指標之一。同時，研究PD-L1 介導的免疫逃避機制及阻斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法將成為乳腺癌免疫治療的新方向。