高 磊，曹 蕾，王瑞芳，馮丹丹，薛 娟

人臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）數(shù)量豐富，在組織工程和細胞治療領域具有很大的應用價值[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)人UCMSCs具有免疫調(diào)節(jié)和分化為肝細胞的能力，在治療肝臟疾病方面有顯著的療效[2-4]。酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是臨床普遍存在的一種慢性酒精中毒引起的酒精性肝病。甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）是中草藥甘草的主要有效成分，具有抗炎、加強肝臟的解毒功能和減輕肝細胞的損傷作用，在肝病治療領域被廣泛應用[5]。本文采用人UCMSCs移植和甘草酸處理ALD大鼠，觀察了其對酒精性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、藥物與儀器 40只健康SD大鼠，體質(zhì)量為（110±20）g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗技術有限公司【許可證號SCXK（京）2011-0011】。Ⅱ型膠原酶（Sigma，美國）；D-Hank’s液、胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、Mesen PRO RSTMMedium（Gibico，美國）；市售 56?紅星二鍋頭；檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木精-伊紅染色液（北京索萊寶）；TransScript One-Step cDNA 合成試劑盒和Tap PCR Mix（北京全式金生物技術有限公司）；CYP2B1引物設計及合成（金斯瑞生物科技公司）。GL為本實驗室自制。光學顯微鏡（Olympus，日本）；低溫高速離心機（Thermo，美國）；PCR 分析儀（ABI，美國）；酶標儀（Bio Tek，美國）；恒溫震蕩儀（其林貝爾儀器設備有限公司）；6孔板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿（Coming，美國）。

1.2 UCMSCs培養(yǎng)[6]本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。經(jīng)過產(chǎn)婦知情同意后，采集正常足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶組織，置入Hank’s液，4℃保存。在超凈臺內(nèi)取出臍帶，用PBS沖洗血液，用手術刀剔除臍帶內(nèi)血管，將臍帶剪成1～2 mm3組織塊，放入培養(yǎng)瓶，加入Ⅱ型膠原酶消化，過濾、收集細胞，接種在6孔板內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。96 h后半量更換培養(yǎng)液，以后隔半天半量換液，顯微鏡下觀察，大約10 d后，細胞融合達到80%時，進行傳代培養(yǎng)。

1.3 慢性ALD動物模型的建立與細胞移植干預[7]取40只SD大鼠，正常飼養(yǎng)1 w，給予其中30只白酒10 ml·kg-1灌胃，早晚各一次，連續(xù)30 d。待大鼠狀態(tài)變差，活動減少，精神萎靡，毛發(fā)無光澤時，即建立慢性ALD模型成功。將ALD動物隨機分為模型組（B組）、臍帶間充質(zhì)干細胞移植組（C組）和臍帶間充質(zhì)干細胞聯(lián)合甘草酸處理組（D組）。給予B組動物生理鹽水1 ml，給予C組動物UCMSCs（1×1010/L）1 ml，給予 D 組動物 UCMSCs （1×1010/L）和甘草酸（100 mg·kg-1）1 ml，門靜脈注射，另10只為對照組（A組），給予生理鹽水1 ml門靜脈注射。

1.4 血清檢測 在細胞移植2 w后，經(jīng)尾靜脈取血，4℃、4000 r/m離心10 min，分離血清，于 -20℃冰箱保存，備測。

1.5 肝組織病理學檢查 取血后，即刻取出肝臟，取部分肝組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.6 肝組織細胞色素P450亞酶（CYP2B1）mRNA水平檢測 采用RT-PCR法，在液氮中研磨肝組織，加入Trizol溶液提取總RNA。應用核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳對提取的RNA進行分析。取總RNA 4μL，82℃水浴5 min，加入反轉(zhuǎn)錄反應液，44℃孵育60 min，留取產(chǎn)物待用。引物見表1，擴增參數(shù)，95℃ 10 min，60℃ 50 s，72℃延伸 50 s，72℃延伸10 min，10℃保存?；蛩椒治霾捎?2-△Ct法，將GAPDH設為內(nèi)參，取Ct值。計算公式為：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（GAPDH）；△△Ct=△Ct（實驗組）-△Ct（對照組）。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05判定為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學變化 A組大鼠肝組織結(jié)構完整，肝小葉結(jié)構清晰，細胞形態(tài)規(guī)則，細胞核圓形，胞質(zhì)豐滿，無異常改變（圖1A）；B組大鼠肝小葉界限不清晰,肝細胞索排列紊亂，細胞核模糊不清，肝細胞胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的圓形脂肪空泡，部分肝細胞腫脹,可見點灶壞死和部分炎性細胞浸潤（圖1B）；C組和D組肝損傷有不同程度的減輕，以D組減輕較明顯（圖1C、圖1D）。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學變化（HE,400×）

2.2 UCMSCs形態(tài)學觀察結(jié)果 體外培養(yǎng)細胞3～5 h，細胞開始貼壁，48 h完全貼壁，出現(xiàn)長梭形和少量成纖維樣細胞。隨著傳代次數(shù)的增加，成纖維樣的UCMSCs增殖速度加快，擴增純化后的第3代臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)似長梭形，呈輻射狀生長（圖2）。

圖2 人臍帶間充質(zhì)干細胞（200×）

2.3 各組大鼠血清指標水平比較 與A組比，B組大鼠血清AST、ALT和MDA水平顯著升高，而SOD和GPx水平顯著降低；與B組比，C組和D組血清AST、ALT和MDA水平顯著下降（P＜0.05），SOD和GPx水平顯著升高（P＜0.05，表2）。

表2 各組大鼠血清指標（±s）比較

表2 各組大鼠血清指標（±s）比較

與A組比，①P＜0.05；與B組比，②P＜0.05；與C組比，③P＜0.05

只 AST（U/L） ALT（U/L） MDA（μmo/L） SOD（U/L） GPx（U/ml）A 組 10 85.5±12.7 30.8±4.5 0.6±0.1 225.7±16.4 912.3±29.5 B組 10 210.6±26.0① 111.2±13.7① 1.6±0.1① 141.3±6.9① 336.5±26.1①C組 10 106.3±13.6①② 50.6±8.7①② 1.0±0.1①② 173.1±10.4② 668.9±22.4②D 組 10 90.7±6.6②③ 36.2±5.1②③ 0.7±0.1②③ 198.1±12.3②③ 885.2±25.4②③F 130.132 176.440 202.502 90.103 1049.854 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組肝組織CYP2B1 mRNA水平比較 與A組比，B組肝組織CYP2B1 mRNA水平顯著降低；與B組和C組比，D組肝組織CYP2B1 mRNA水平顯著增強，差異有顯著性統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組肝組織CYP2B1 mRNA水平比較

3 討論

研究指出，酒精中的乙醇在代謝時產(chǎn)生大量的自由基，致使肝細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，能引起肝臟組織中的肝細胞損傷和死亡，導致轉(zhuǎn)氨酶升高。酒精代謝過程中產(chǎn)生的乙醛會對肝細胞產(chǎn)生毒性作用，抑制谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成，減弱SOD等抗氧化能力，導致大量MDA等氧化物的生成[8，9]。MDA的含量可以反映出機體細胞受自由基攻擊的程度，SOD、GSH的活性高低是反映機體抗氧化能力的指標[10]。ATL和AST存在于肝細胞漿中，當肝細胞受損時，可使血清ATL和AST水平升高，是肝損傷的敏感指標。ATL和AST的大量釋放，會加速SOD、GPx的消耗，引起細胞腫脹，肝功能異常，增強肝組織損傷程度[11，12]。本實驗結(jié)果顯示，相對于正常的大鼠，模型組大鼠肝組織受損后血清ALT、AST和MDA水平顯著升高，而血清SOD和GPx水平顯著降低。在臍帶間充質(zhì)干細胞移植組和臍帶間充質(zhì)干細胞移植聯(lián)合甘草酸處理組大鼠血清ALT、AST和MDA水平均顯著下降，SOD和GPx水平顯著升高。臍帶間充質(zhì)干細胞移植聯(lián)合甘草酸處理組血清ALT、AST和MDA水平下降明顯，SOD和GPx水平進一步增高。

CYP2B亞家族與肝臟藥物代謝的作用有關，CYP2B可以催化底物，具有解毒的作用。CYP2B1蛋白是肝細胞特征性功能蛋白[13]。在本實驗中，與模型組或臍帶間充質(zhì)干細胞移植組比，臍帶間充質(zhì)干細胞移植聯(lián)合甘草酸處理組動物肝組織肝細胞特征性功能蛋白CYP2B1 mRNA水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義。

目前，尚缺乏理想的治療ALD的藥物，而甘氨酸是很早就被用于治療肝病的藥物，實驗及臨床研究報道，應用甘氨酸能改善肝組織的病理學損傷，減慢肝細胞壞死的進程，血清ALT水平下降，恢復肝細胞內(nèi)肝糖元和核酸代謝，促進膽紅素代謝，具有抗病毒、抗炎和抗肝纖維化的作用[14-17]。干細胞移植又是近年來組織工程研究的新領域，兩者的結(jié)合將會為肝損傷的治療提供新的方法。研究表明UCMSCs在特定的條件下可以向肝細胞分化，在體外動物實驗發(fā)現(xiàn)對肝臟疾病有一定的治療作用，并且由于其取材方便、來源廣、獲得方便，將會成為肝病治療領域里的理想選擇[18-20]。在臨床上，研究也顯示UCMSCs移植能改善肝病患者的肝功能及臨床癥狀，提高患者的生存率。

綜上所述，UCMSCs移植能夠有效地保護酒精所致的肝損傷，與甘氨酸聯(lián)合使用后效果更明顯，其機制可能與抗自由基及脂質(zhì)過氧化有關。