張傳志 周庾 胡曉波 劉莉

重慶市中醫(yī)院(重慶市第一人民醫(yī)院)骨二科,重慶 400100

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由雌激素水平下降引起的一種全身性骨代謝疾病，其發(fā)病率在老年婦女中高達(dá)52%[1]。 既往研究[2]表明，mRNA在細(xì)胞增殖、分化、分裂、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用，并參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。而最近的研究[3-4]證實(shí)，各種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)如母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)，可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及表觀遺傳學(xué)水平來參與疾病的發(fā)生，是一種重要的調(diào)節(jié)因子。越來越多的證據(jù)[4-5]表明MEG3在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過程中起著重要作用。MEG3與BMSC的異常分化誘導(dǎo)密切相關(guān)，但是MEG3與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系尚未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19、DANCR可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化。三種長(zhǎng)鏈非編碼RNA已在體外實(shí)驗(yàn)中被證明了其對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，但在體內(nèi)的影響還未開展相關(guān)研究。淫羊藿苷是從天然植物中提取的黃酮類藥物，已被證明有促進(jìn)成骨與抑制破骨的雙重作用。本研究旨在通過淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松新西蘭白兔，檢測(cè)其不同部位骨的長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3/H19/DANCR的表達(dá)情況，同時(shí)研究其對(duì)股骨顯微結(jié)構(gòu)變化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1建立OVX模型：選取未生育的7月齡健康成年新西蘭白兔48只，體重(1.6±0.29)kg。在10天的適應(yīng)期后，根據(jù)體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、去卵巢模型組(OVX)和淫羊藿苷治療組(OVX加治療)。 假手術(shù)組實(shí)施手術(shù)切除雙側(cè)卵巢周圍脂肪一塊；去卵巢模型組與淫羊藿苷治療組在使用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對(duì)腹腔進(jìn)行注射全麻后，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，雙側(cè)切口長(zhǎng)約3～4 cm。術(shù)后每天觀察動(dòng)物的切口直至愈合。

1.1.2淫羊藿苷給藥：行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后4周，淫羊藿苷治療組給予淫羊藿苷[20 mg/(kg·d)]灌胃[8]，去卵巢模型組與假手術(shù)組每天給予等量的生理鹽水灌胃，持續(xù)8周。術(shù)后12周，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施安樂死后取其雙側(cè)的股骨與腰椎(L5)備用。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT分析骨質(zhì)疏松模型的建立：用70%的乙醇對(duì)取得的新西蘭白兔股骨進(jìn)行固定。24 h后對(duì)股骨頭進(jìn)行micro-CT(SkyScan 1072)掃描，使用相關(guān)分析軟件(SkyScan，Belgium)進(jìn)行分析，圖像采集時(shí)所選擇的電壓和電流為100 kV、98 mA，將樣本密封在緊密的塑料包里以避免在掃描過程中出現(xiàn)移動(dòng)或樣品出現(xiàn)脫水。對(duì)圖像進(jìn)行閾值分割以從背景圖像中分割出骨的圖像。通過配套的3D軟件將2D圖像通過3D渲染獲得3D模型。微CT圖像分辨率為18.2 μm。再根據(jù)三維圖像對(duì)標(biāo)本的骨參數(shù)進(jìn)行分析，具體包括：骨體積/總體積(BV/TV)，骨表面積/骨體積(BS/BV)，骨小梁的分離度Tb·Sp，骨小梁的厚度Tb·Th，骨小梁的數(shù)量(Tb·N)。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)：在骨質(zhì)疏松模型建立的第12周時(shí)通過qRT-PCR檢測(cè)兩組股骨、椎骨組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3、H19、DANCR的表達(dá)水平以及Runx2的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)試劑盒說明書用Trizol提取細(xì)胞的總RNA(Invitrogen)。實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度?？俁NA的反轉(zhuǎn)錄遵循反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)操作說明，PCR的擴(kuò)增使用實(shí)時(shí)定量PCR的預(yù)混合溶液SYBR Green qPCR Master Mix(Thermo)，擴(kuò)增之后的MEG和Runx2的相對(duì)表達(dá)分析以GAPDH 作為內(nèi)源參照基因，引物由上海生工合成，具體見表1。獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以減少誤差，結(jié)果的計(jì)算采用2-ΔΔCt法。

表1 qRT-PCR中應(yīng)用的引物序列Table 1 The primer sequences for qRT-PCR

1.2.3免疫組化檢測(cè)BMP2：采用S-P法，假手術(shù)組和去卵巢模型組一抗用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替,其余各步均同淫羊藿苷治療組，步驟如下：①切片脫蠟入水：將切片分別浸泡于二甲苯液中30 min、無水酒精中5 min、95 %酒精中5 min、75 %酒精中5 min，用蒸餾水清洗2次，在PBS(pH=7.4)中浸泡5 min；②內(nèi)源性過氧化物酶阻斷：滴加A液50 μL于切片上，室溫孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；③抗原修復(fù)：切片浸泡于0.1 mol/L EDTA修復(fù)液中,加溫至99 ℃并保持10 min，任其自然冷卻至室溫，在PBS中浸泡5 min(3次)；④非免疫血清封閉：滴加B液50 μL于切片上，室溫孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑤滴加一抗：淫羊藿苷治療組滴加鼠抗兔抗體，假手術(shù)組和去卵巢模型組使用PBS代替，室溫下孵育60 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑥滴加二抗：滴加羊抗鼠抗體液于切片上，室溫孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑦滴加抗生物-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑧滴加過氧化物酶底物，顯微鏡下觀察6 min，當(dāng)部分切片出現(xiàn)較強(qiáng)的棕黃色產(chǎn)物時(shí)，用PBS終止顯色反應(yīng)，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑨用蒸餾水沖洗，在鹽酸中浸泡2 s后再用蒸餾水沖洗；⑩脫水、封片：在95 %酒精中浸泡5 min，在無水酒精中浸泡10 min，烘干，鏡下觀察，顯微攝影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 顯微CT分析骨質(zhì)疏松模型的建立

由表2、圖1可見，骨質(zhì)疏松模型建立成功。與去卵巢模型組相比，經(jīng)淫羊藿苷干預(yù)后，骨質(zhì)疏松兔股骨頭的BV/TV升高了41.86 %(P<0.01)、Tb·Th升高34.78 %(P<0.05)、Tb·N升高41.05 %(P<0.01)，BS/BV降低30.76 %(P<0.05)，Tb·Sp降低36.58 %(P<0.05)。

表2 顯微CT對(duì)股骨頭的顯微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Table 2 Results of microct analysis of

注：與去卵巢模型組比較，**P<0.01；與去卵巢模型組比較，*P<0.05。

圖1 股骨3D圖像Fig.1 3D image of femur

2.2 不同部位骨的長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3/H19/DANCR的表達(dá)情況

表3所示，淫羊藿苷治療組股骨中MEG3、H19、DANCR的表達(dá)與去卵巢模型組相比明顯升高，分別升高38.1 %(P<0.01)、44.9 %(P<0.01)、49.15 %(P<0.01)，椎骨中H19、DANCR的表達(dá)與去卵巢模型組相比無明顯變化(P>0.05)，MEG3的表達(dá)與去卵巢模型組相比升高64 %(P<0.01)。顱骨中MEG3、H19的表達(dá)與去卵巢模型組相比無明顯變化(P>0.05)，然而DANCR的表達(dá)與去卵巢模型組相比升高了31.25 %(P<0.05)。股骨、椎骨(L5)、顱骨中Runx2與去卵巢模型組相比分別升高32.97 %(P<0.05)、29.79 %(P<0.05)、29.41 %(P<0.05)。

表3不同部位骨中l(wèi)ncRNA MEG3/H19/DANCR的表達(dá)

Table3Expression of lncRNA MEG3/H19/DANCR in different bones

基因 假手術(shù)組去卵巢模型組淫羊藿苷治療組股骨MEG31.05±0.090.63±0.08??0.87±0.11??lnc-H191.31±0.070.49±0.040.71±0.06??DANCR1.14±0.080.59±0.05??0.88±0.09??Runx21.58±0.080.91±0.16?1.21±0.14?椎骨MEG30.49±0.050.25±0.07??0.41±0.4??lnc-H190.99±0.110.87±0.090.93±0.12DANCR0.84±0.050.83±0.120.97±0.1Runx20.86±0.140.47±0.13?0.61±0.12?顱骨MEG30.29±0.090.31±0.080.27±0.11lnc-H190.58±0.080.51±0.070.46±0.06DANCR0.35±0.050.16±0.02?0.21±0.03?Runx20.63±0.090.34±0.04??0.44±0.09?

注：與去卵巢模型組比較，**P<0.01；與去卵巢模型組比較，*P<0.05。

2.3 免疫組化檢測(cè)股骨頸中BMP2的表達(dá)

由圖2可知，三組免疫組化結(jié)果中，淫羊藿苷治療組胞漿、核周或細(xì)胞外基質(zhì)的棕黃色顆粒狀染色最多，說明淫羊藿苷治療組股骨頸中的BMP2表達(dá)最高，其次為假手術(shù)組，去卵巢模型組股骨頸中的BMP2表達(dá)最低。

圖2 免疫組化檢測(cè)股骨頸中BMP2的表達(dá)Fig.2 Immunohistochemical detection of BMP2 expression in the neck of femur

3 討論

淫羊藿苷是淫羊藿中含量最豐富的一種黃酮類成分，具有良好的骨再生和修復(fù)作用[9]。越來越多的證據(jù)[10]表明淫羊藿苷可通過刺激骨形成同時(shí)抑制骨吸收而在骨轉(zhuǎn)化的平衡中發(fā)揮雙重作用，因此天然植物中提取的淫羊藿苷成為了防治骨質(zhì)疏松癥的一種具有潛力的替代品。重要的是，作為一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的藥物，它可以加載在生物材料上進(jìn)成局部的釋放，形成局部的骨誘導(dǎo)[11-12]。最新的證據(jù)[13]表明，lncRNA是一種長(zhǎng)度≥200個(gè)核糖核酸的非編碼RNA，它在多種生物學(xué)過程(如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤發(fā)生)中起著重要作用。既往研究關(guān)注于骨質(zhì)疏松治療藥物對(duì)mRNA的影響，然而越來越多的證據(jù)[14-15]表明MEG 3對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)[16]，絕經(jīng)期后MEG 3和miR-133a-3p的表達(dá)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)呈正相關(guān)，長(zhǎng)鏈非編碼MEG3通過靶向調(diào)控miR-133a-3p的表達(dá)從而抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19僅從母系遺傳等位基因轉(zhuǎn)錄，不編碼蛋白質(zhì)，H19在進(jìn)化過程中高度保守以及外顯子的突變率很低的特點(diǎn)使其具有重要的生物學(xué)功能，同時(shí)，H19已被證明是成骨細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一[6,17]，因此筆者推測(cè)H19可能與骨相關(guān)疾病有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)DANCR可通過誘導(dǎo)的IL-6和TNF-α促進(jìn)骨的吸收，可以作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物[7]。此外，DANCR還可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，是成骨細(xì)胞分化的重要介質(zhì)[18]。因此本次研究把焦點(diǎn)放在這3個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA上，探討了淫羊藿苷對(duì)這3種非編碼RNA在骨質(zhì)疏松兔股骨、腰椎(L5)、顱骨上表達(dá)的影響。筆者在淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松模型中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷干預(yù)后股骨中H19的RNA表達(dá)上調(diào)，與之前的研究一致[19]。

研究表明，RUNX 2是成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵性因子，在對(duì)821名西班牙絕經(jīng)期婦女的研究中[20]發(fā)現(xiàn)，RUNX2與腰椎和股骨頸的骨密度有關(guān)。此次研究通過PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷干預(yù)骨質(zhì)疏松兔模型的RUNX2。BMP 2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2)通過促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨形成與修復(fù)；此次研究的免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)淫羊藿苷治療后的BMP2在股骨頸中表達(dá)最高。本次研究中證明淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松兔的模型有明顯效果，與之前的研究[9]一致，外源性的淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松的作用表現(xiàn)在使脛骨的骨小梁增加。有意思的是，淫羊藿苷對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(MEG3、H19、DANCR)的影響主要表現(xiàn)在股骨，對(duì)椎骨、顱骨的影響分別表現(xiàn)在MEG3和DANCR的影響，淫羊藿苷可通過促進(jìn)股骨的MEG3、H19、DANCR的表達(dá)來促進(jìn)骨質(zhì)疏松的治療。

綜上，股骨中3個(gè)lncRNA(MEG3、H19、DANCR)的表達(dá)與成骨基因RUNX2和BMP2表達(dá)上調(diào)有關(guān)。由于本次研究具有局限性，未來的研究可以進(jìn)一步驗(yàn)證不同骨中l(wèi)ncRNA(MEG3、H19、DANCR等)的表達(dá)與成骨基因RUNX2和BMP2的關(guān)系，以及淫羊藿苷影響骨質(zhì)疏松具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。