董瑩瑩 王猛 郭艷 張海軍 蘇鳳艷

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘卣鞯囊环N全身性骨骼疾病[1]，該病多發(fā)于絕經(jīng)后婦女及中老年人，全球的總患病率為6.6%～19.3%[2]，其中在中國調(diào)查顯示其發(fā)病率高達25%[3]。預(yù)計到2025年，中國患骨質(zhì)疏松癥或骨密度低的患者將達到2.12億[4]。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥主要由骨代謝紊亂引起，其中骨形成和骨吸收之間的不平衡起主要作用。新骨形成主要由成骨細胞介導(dǎo)，而骨吸收主要取決于破骨細胞的功能。因此，在正常骨重建的過程中，無論是促進成骨細胞增殖或誘導(dǎo)成骨細胞分化均可增強骨形成[5-6]。

地塞米松(dexamethasone,Dex)是一種人工合成的長效糖皮質(zhì)激素，由地塞米松所引起的骨質(zhì)疏松被稱為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(glucocorticoid induced osteoporosis,GIOP)。GIOP屬于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，其發(fā)病率僅次于原發(fā)性骨質(zhì)疏松，長期高劑量的注射地塞米松會導(dǎo)致成骨細胞和骨細胞凋亡，因此GIOP引起了人們的關(guān)注[7]。本研究以低鈣飼料聯(lián)合地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松的模型為研究對象，以骨密度(bone mineral density,BMD)、骨組織形態(tài)學(xué)作為主要評價指標(biāo)，考察造模情況，以期獲得一種耗時短、節(jié)約成本且效果更佳的骨質(zhì)疏松動物模型建模方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：3月齡雌性SD大鼠20只，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2015-0003，體重(310±10)g。

1.1.2藥品：地塞米松磷酸鈉注射液(國藥準(zhǔn)字1137021969，辰欣藥業(yè)股份有限公司)，甲醛，生理鹽水，乙醚。

1.1.3飼料：正常飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，鈣離子含量為1.22 %；低鈣飼料，配方見表1。

表1 低鈣飼料配方(Ca2+含量0.04%)Table 1 Low calcium feed formula (Ca2+ content 0.04%)

1.1.4儀器：OSTEOCORE-3型錐狀二維快閃式全數(shù)字雙能 X 線(DEXA)骨密度儀(法國MEDILINK 公司，中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科提供)，LEICA RM2235切片機(德國，上海聚慕醫(yī)療器械)，760CRT雙光束紫外可見分光光度計(中國，北京京科瑞達科技有限公司)，顯微鏡及顯微拍攝系統(tǒng)(德國, Leica)，火焰原子吸收光譜儀(德國,耶拿公司)，馬福爐(中國，上海博訊實業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及處理：將SD 大鼠隨機分為空白對照組(正常飼料+生理鹽水)和模型組(低鈣飼料+地塞米松)，每組10只，在無菌條件下進行封閉式飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間允許動物自由采食、飲水，室內(nèi)相對溫度為19 ℃～23 ℃，相對濕度為(40±10)%。模型組每3天注射一次地塞米松，按照1 mg/kg的給藥劑量對大鼠腿部進行肌肉注射，空白組每3天注射一次等量的生理鹽水，共6周。

1.2.2骨密度的測量：分別于給藥第4周處死4只大鼠、第6周處死6只大鼠，取其股骨組織，通過骨密度儀對其進行骨密度測量。

1.2.3骨灰分及鈣、磷含量的測定：第6周處死大鼠后將其骨組織放入馬福爐高溫加熱6 h，測定灰分含量。取少量燒好的組織加入10 mL高氯酸濃硫酸混合液(1∶5)，之后經(jīng)高溫消化4 h，將消化好的溶液定容到25 mL容量瓶中備用。通過紫外分光光度進行磷的測定，通過火焰原子吸收分光光度進行鈣含量的測定。

1.2.4血清指標(biāo)的檢測：取200 μL血清，在血清中加入10 mL高氯酸濃硫酸混合液(1∶5)，之后高溫消化4 h，將消化好的溶液定容到25 mL容量瓶中備用。通過紫外分光光度進行血清中磷濃度的測定，通過火焰原子吸收分光光度進行血清中鈣含量的測定。

1.2.5組織病理學(xué)觀察：將大鼠股骨組織用4%多聚甲醛液固定2 d，用5%～10%的濃硝酸溶液將骨組織脫鈣12～24 h，按常規(guī)脫水、透明、包埋、石蠟切片，厚 4～5 μm，常規(guī) HE 染色，用顯微鏡在400倍鏡下觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 健康指標(biāo)

從實驗開始，每日早上8:00對各組大鼠進行稱重，觀察大鼠的各項生命體征，并且每周稱取兩次攝水、攝食量，觀察并記錄大鼠基礎(chǔ)健康指標(biāo)的變化情況?？瞻捉M大鼠毛發(fā)光潔，活動體態(tài)正常，模型組大鼠毛色無光澤、稀疏、四肢爪部常有斷裂。大鼠體重實驗結(jié)果顯示(圖1)，整個飼養(yǎng)期間模型組的體重在前3周處于下降的趨勢，之后趨于平穩(wěn)。由于注射地塞米松的原因，導(dǎo)致模型組體內(nèi)營養(yǎng)成分流失加速，致使體重下降，空白組的體重一直保持著持續(xù)上升的狀態(tài)；大鼠攝水實驗結(jié)果顯示(圖2)，模型組的攝水量從第2周開始下降，從第3周之后趨于平穩(wěn)，由于模型組注射地塞米松的原因使大鼠的飲水量增加，因此模型組的攝水量顯著高于空白組。

2.2 骨指標(biāo)

2.2.1骨密度：第4周大鼠骨密度實驗結(jié)果顯示(圖3)，模型組大鼠股骨上段和下段與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，只有空白組股骨中段的骨密度高于模型組，且差異顯著(P<0.05)，不能證明造模成功；第6周大鼠骨密度實驗結(jié)果顯示(圖4)，模型組大鼠股骨上段、中段、下段的骨密度均顯著低于空白組(P<0.01)，從骨密度的結(jié)果可以初步確定造模成功。

圖3 地塞米松+低鈣飼料對大鼠4周骨密度的影響Fig.3 Effect of dexamethasone + low calcium diet on bone mineral density of rats at four weeks注：與空白組比較, #P< 0.05。

圖4 地塞米松+低鈣飼料對6周大鼠骨密度的影響Fig.4 Effect of dexamethasone + low calcium diet on bone mineral density of rats at six weeks注：與空白組比較, *P< 0.01。

2.2.2骨組織干重和灰重比：第6周大鼠骨組織灰分及灰重/干重實驗結(jié)果顯示(表2)，模型組的灰分顯著低于空白組(P<0.01)，且模型組灰重/干重極顯著低于空白組(P<0.01)。

表2 兩組大鼠骨組織灰重、干重Table 2 Bone tissue gray weight / dry weight of two groups rats

注：與空白組比較,*P< 0.01。

2.2.3骨組織中鈣、磷的含量：第6周時骨組織鈣、磷含量實驗結(jié)果顯示(圖5)，模型組鈣的含量顯著低于空白組(P<0.01)，模型組磷的含量顯著低于空白組(P<0.01)。

圖5 地塞米松+低鈣飼料對大鼠骨鈣磷的影響Fig.5 Effects of dexamethasone + low calcium feed on bone calcium and phosphorus in rats注：與空白組比較，*P<0.01。

2.3 血清指標(biāo)

由圖6和圖7可見，造模6周時，模型組血清鈣濃度顯著高于空白組(P<0.01)；模型組血清磷濃度顯著低于空白組(P<0.01)。

圖6 地塞米松+低鈣飼料對大鼠血鈣的影響Fig.6 Effect of dexamethasone + low calcium diet on serum calcium in rats注：與空白組比較, *P<0.01。

圖7 地塞米松+低鈣飼料對大鼠血磷的影響Fig.7 Effect of dexamethasone + low calcium diet on blood phosphorus in rats注：與空白組比較, *P<0.01。

2.4 H&E染色

從大鼠的骨組織形態(tài)學(xué)可看出(圖8)，空白組的骨小梁完整;模型組的骨小梁多已斷裂，無完整的骨小梁，出現(xiàn)大量的脂肪細胞。

圖8 各組光鏡下觀察(×400，橢圓處為骨小梁，箭頭處為脂肪細胞)Fig.8 Each group under light microscope observation (×400), blank group diagram arrow indicates intact trabecular bone, model group diagram arrow indicates fat cell

3 討論

近年來我國骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率迅速上升，已經(jīng)成為社會關(guān)注的焦點。骨質(zhì)疏松被人們稱為“無聲殺手”，因為它是在人們未察覺的情況下產(chǎn)生的，且這一疾病沒有根治的方法，只能通過長期服用藥物來延緩病情的發(fā)展。美國骨質(zhì)疏松治療費用每年已經(jīng)達到上百億美元，并且由于其高昂的防治費用及患者對家庭成員的依賴，給社會造成了沉重的負擔(dān)。骨質(zhì)疏松是當(dāng)今社會中老年人及婦女的多發(fā)病，目前全球發(fā)病的人數(shù)已經(jīng)達到2億人[8]。骨質(zhì)疏松主要分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松、特發(fā)性骨質(zhì)疏松，原發(fā)性骨質(zhì)疏松主要是由于人們增長到一定年齡而自然產(chǎn)生的，繼發(fā)性骨質(zhì)疏松則是由于一些外力影響所產(chǎn)生的，如藥物、長期臥床等[9]，特發(fā)性骨質(zhì)疏松的原因尚不明確。

目前建造骨質(zhì)疏松的動物實驗中多選用3月齡大鼠，常用的方法主要是去勢、維甲酸誘導(dǎo)法和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)法，還有采用長期飼喂低鈣飼料來誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型。但這些方法均存在缺點，大鼠去勢的方法操作困難，對環(huán)境手法等要求較高；維甲酸給藥劑量為80 mg/kg，造模時間為21 d[10]，維甲酸雖然造模時間短但價格昂貴；傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素建模大概需要60 d[11]，造模時間較長；單純的低鈣飼料造模時間需20周[12]，造模時間更長。因此本研究從節(jié)省成本、節(jié)約時間等多方面考慮采用低鈣飼料聯(lián)合地塞米松進行造模。劉和娣等[13]亦采用地帶米松+低鈣飼料法造模，但時間較長。本研究采用地塞米松+低鈣飼料(鈣含量0.004%)，造模時間縮短兩周，且操作簡單、價格低廉。

Dex廣泛用于自身免疫性疾病和炎癥治療[14]，長期使用Dex會增加骨質(zhì)疏松癥甚至股骨頭壞死的風(fēng)險[15]，Dex能增加脂肪細胞的生成，減少成骨細胞[16]；低鈣飼料的食用可致使動物體內(nèi)的鈣含量降低，最終形成骨質(zhì)疏松。Dex是一種人工合成的長效糖皮質(zhì)激素，通過直接抑制骨細胞、成骨細胞活性和增加破骨細胞骨吸收兩個階段影響骨代謝，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[17]。

本研究通過評估骨密度來判定是否造模成功，通過骨組織灰重和干重比、骨鈣離子和磷離子的含量、血清Ca、P濃度和骨組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)來進一步確定大鼠的造模情況。

骨密度全稱骨骼礦物質(zhì)密度，是評價骨骼強度及骨質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，可以反映骨質(zhì)疏松程度，是預(yù)測骨折危險性的重要依據(jù)，也是判定骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵因素[18]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第4周模型組股骨上、中、下段骨密度與空白組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P≥0.05)，說明造模未成功；第6周模型組大鼠股骨上、中、下段骨密度與空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)，說明造模成功。

骨灰重/干重是反映骨礦含量的重要指標(biāo)，比值越低，骨無機質(zhì)的含量越低；此次研究結(jié)果顯示，模型組的灰重/干重顯著低于空白組(P≤0.05)，說明長期塞米松+低鈣飼料能降低骨中無機物質(zhì)的含量，使骨代謝水平發(fā)生了改變；鈣磷代謝是影響骨代謝的重要指標(biāo)，當(dāng)骨中鈣含量不足時則會使血液中的鈣轉(zhuǎn)化為骨鈣磷來維持骨中的鈣磷[19-20]；血液中的鈣磷離子還保持著一定的數(shù)量關(guān)系，當(dāng)其數(shù)量不在規(guī)定的范圍內(nèi)則會引發(fā)骨骼疾病。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)第6周的血清指標(biāo)中，模型組Ca的含量顯著高于空白組(P≤0.05)，模型組P的含量顯著低于空白組(P≤0.05)，說明骨吸收增加；模型組骨組織中Ca、P的含量均顯著低于空白組，說明長期的地塞米松+低鈣飼料能增強破骨細胞的形成，且能抑制成骨細胞的增殖、分化，降低成骨細胞活性，并使成骨細胞凋亡；從生化指標(biāo)和骨鈣磷含量可以明顯看出模型組的骨吸收大于骨形成，說明地塞米松+低鈣飼料造模效果顯著。人骨髓間質(zhì)干細胞是具有多向分化能力的細胞,在成人體內(nèi)主要分化為成骨和脂肪細胞，伴隨著脂肪組織在骨髓中的含量增加,成骨細胞在骨髓中的含量會明顯減少[21]。從大鼠脛骨組織形態(tài)學(xué)可見，模型組骨小梁多已斷裂，幾乎無完整的骨小梁，且出現(xiàn)大量的脂肪細胞,說明體內(nèi)成骨細胞減少，表明地塞米松+低鈣飼料已使骨組織顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，呈現(xiàn)出骨質(zhì)疏松的狀態(tài)。

綜上所述，利用低鈣飼料聯(lián)合地塞米松肌肉注射方法建立大鼠骨質(zhì)疏松模型切實可行，低鈣飼料聯(lián)合地塞米松的使用可以進一步加速骨丟失。此法操作簡單、周期短、費用低廉且建模效果好，是一種較好的建立骨質(zhì)疏松實驗動物模型的方法。