諸靜其 華婷 徐子軍 唐睿 湯光宇

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院放射科，上海 200072

骨髓微環(huán)境主要由骨髓基質(zhì)、微血管、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、造血細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子等組成，骨髓中脂肪細(xì)胞的變化與年齡的增長、退行性骨病以及血液疾病等關(guān)系密切[1-4]。因此，定量檢測骨髓中脂肪含量對于評估骨骼生理和病理動態(tài)變化以及療效隨訪具有重要臨床價值。

質(zhì)子磁共振波譜(proton magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS)是目前被廣泛接受的無創(chuàng)量化骨髓脂肪酸的影像學(xué)檢查方法，人類和動物骨髓包括紅骨髓和黃骨髓，骨髓1H-MRS譜線中水峰峰值信號強(qiáng)度主要來源于紅骨髓，而脂峰峰值信號強(qiáng)度主要來源于黃骨髓，這是骨髓1H-MRS的成像基礎(chǔ)。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外活體骨髓1H-MRS的研究主要用于人類及大中型動物[5-6]，尚未見該技術(shù)用于測定小型動物(如大鼠、小鼠)骨髓脂肪含量的研究報道。

本研究的目的旨在探討利用臨床商用3.0 T磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)掃描儀對大鼠椎體進(jìn)行骨髓1H-MRS掃描的可行性，為大鼠疾病模型骨髓脂肪研究提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

隨機(jī)選取健康清潔級3月齡雌性SD大鼠20只，未曾交配，體質(zhì)量為250～290 g，由同濟(jì)大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供，所有動物購入后分籠飼養(yǎng)(≤5只/籠)于同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院動物房(室溫為20 ℃～25 ℃，濕度60%～80%，環(huán)境清潔，通風(fēng)良好，12 h光和12 h黑暗交替)，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后15只大鼠進(jìn)行影像學(xué)及病理學(xué)檢查，另5只大鼠經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛(劑量：10 mL/kg)麻醉后行雙側(cè)卵巢切除術(shù)制作骨質(zhì)疏松模型(尸解發(fā)現(xiàn)子宮萎縮、變細(xì)判為模型制作成功)，術(shù)后9周進(jìn)行影像學(xué)及病理學(xué)檢查，手術(shù)完畢后所有大鼠送回動物房自由飲食。本實驗獲得同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，并依據(jù)2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》對動物進(jìn)行實驗處理。

1.2 腰椎1H-MRI檢查

1.2.1掃描設(shè)備及線圈：采用德國進(jìn)口西門子3.0 T MRI掃描儀(Magneton Verio)，梯度場強(qiáng)40 mT/m，磁場切換率200 mT/ms，16通道。小動物線圈采用上海晨光醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn)的配套大鼠線圈(型號：CG-MUC18-H300-AS，4通道，孔徑5 cm)。

1.2.2掃描方法：MRI檢查前，4%水合氯醛(劑量：10 mL/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠俯臥位放入線圈，注意線圈應(yīng)包裹整個腰部，腰5椎體位于表面線圈中心，先行腰椎軸位、冠狀位、矢狀位TSE序列T2加權(quán)成像(T2-weighted imaging, T2WI)常規(guī)掃描用于1H-MRS檢查感興趣區(qū)(region of interest，ROI)的定位，具體掃描參數(shù)：TR 2 500 ms，TE 74 ms，視野(FOV)80 mm×80 mm，層厚1.2 mm，矩陣 256×256，掃描層數(shù)11層，掃描時間為114 s。

常規(guī)MRI掃描結(jié)束后采用多體素點分辨波譜法(point-resolved spectroscopy，PRESS)進(jìn)行信號采集，ROI根據(jù)常規(guī)掃描的T2WI圖像定位，大小為30 mm×30 mm×30 mm，一小格體素塊大小為2.5 mm×2.5 mm×5 mm，放置于腰5椎體松質(zhì)骨，避開皮質(zhì)骨和基底血管， 同時通過手動方法在ROI周圍放置上下、前后、左右共6個方向的飽和帶以消除ROI以外的信號對波譜掃描的干擾，飽和帶寬度為55 mm。波譜采集前采用機(jī)器自動預(yù)掃描程序完成勻場，但不進(jìn)行水抑制，然后進(jìn)行不抑水的1H-MRS掃描，具體掃描參數(shù)：TR 750 ms，TE 145 ms，均數(shù)12，掃描時間 284 s。

如基線明顯不穩(wěn)或者水、脂峰出現(xiàn)切跡、反向倒置、過寬以及無法辨認(rèn)則認(rèn)為不合格，需重新進(jìn)行1H-MRS掃描直至達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。每個腰5椎體的FF值均測量兩次，取平均值。

1.3 腰椎病理檢查

1H-MRS檢查結(jié)束后24 h內(nèi)腹腔注射過量4%水合氯醛(劑量：20 mL/kg)處死，取出腰5后取椎體中部骨質(zhì)放入10%甲醛固定24 h，將固定后的骨組織放入4% EDTA脫鈣2周后常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，每個石蠟標(biāo)本制成4 μm厚切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光鏡下大致觀察脂肪細(xì)胞的數(shù)量和分布。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腰5椎體1H-MRS分析

15只正常大鼠腰5椎體1H-MRS顯示水峰明顯高于飽和脂肪酸主峰(長鏈亞甲基質(zhì)子)，而不飽和脂肪酸峰烯烴質(zhì)子和亞甲基質(zhì)子(與烯烴質(zhì)子相連)未見明確顯示(見圖1)。兩名放射科醫(yī)師測得的腰5椎體FF值分別為(10.92±3.31)%、(11.10±3.20)%，95%CI分別為(9.09～12.76)%、(9.33～12.87)%，ICC值為0.954，說明測量骨髓FF值結(jié)果幾乎一致。

圖1 正常3月齡雌性大鼠腰5椎體1H-MRS，水峰(4.65 ppm)明顯高于飽和脂肪酸主峰(長鏈亞甲基質(zhì)子，1.30 ppm)，而不飽和脂肪酸峰烯烴質(zhì)子(5.3 ppm)和亞甲基質(zhì)子(與烯烴質(zhì)子相連)(2.06 ppm)未見明確顯示Fig.1 In a healthy rat aged 3 months, 1H-MRS of the L5 vertebral body showed that water peak (4.65 ppm) was significantly higher than the dominant peak of saturated lipid (bulk methylene protons, 1.30 ppm), but the peaks of unsaturated lipids [olefinic protons (5.3 ppm) and methylene protons (2.06 ppm)] were not obvious.

圖2 骨質(zhì)疏松雌性大鼠腰5椎體1H-MRS，水峰(4.65 ppm)明顯高于飽和脂肪酸主峰(長鏈亞甲基質(zhì)子，1.30 ppm)，但飽和脂肪酸主峰有所升高，不飽和脂肪酸峰烯烴質(zhì)子(5.3 ppm)和亞甲基質(zhì)子(與烯烴質(zhì)子相連)(2.06 ppm)明確顯示，信號振幅較小Fig.2 In an OP rat, 1H-MRS of the L5 vertebral body showed that water peak (4.65 ppm) was also significantly higher than the dominant peak of saturated lipid (bulk methylene protons, 1.30 ppm), but the latter was increased, and the peaks of unsaturated lipids [olefinic protons (5.3 ppm) and methylene protons (2.06 ppm)] were obvious, but the amplitudes were weak.

5只骨質(zhì)疏松大鼠模型術(shù)后9周腰5椎體1H-MRS顯示水峰明顯高于飽和脂肪酸主峰(長鏈亞甲基質(zhì)子)，但飽和脂肪酸主峰有所升高，腰5椎體的FF值為(20.13±4.20)%，而且不飽和脂肪酸峰烯烴質(zhì)子和亞甲基質(zhì)子(與烯烴質(zhì)子相連)明確顯示，信號振幅較小(見圖2)。

2.2 腰5椎體病理觀察

15只正常大鼠腰5椎體HE染色顯示骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞少見，散在分布，體積較小(見圖3)。

5只骨質(zhì)疏松大鼠模型術(shù)后腰5椎體HE染色顯示骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞增多，彌漫分布，體積增大(見圖4)。

圖3 正常3月齡雌性大鼠腰5椎體HE染色顯示骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞(箭)少見，散在分布，體積較小(×200)Fig.3 In a healthy rat aged 3 months, HE staining of the L5 vertebral body showed that adipocytes (arrow) were rare, scattered, and small (×200).

圖4 骨質(zhì)疏松雌性大鼠腰5椎體HE染色顯示骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞(箭)增多，彌漫分布，體積增大(×200)Fig.4 In a OP rat, HE staining of the L5 vertebral body showed that adipocytes (arrow) were increased, diffuse, and large (×200).

3 討論

大鼠體型較小，購買、飼養(yǎng)成本低，對各種造模方法耐受性較好，是比較理想的用于制作各種骨髓疾病模型的小動物。正常大鼠3個月時性腺和內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)育成熟，肌肉、骨骼基本成型，骨代謝活躍，3～6個月時骨骼增長緩慢，6～12個月時骨密度變化最小。因此，理論上3～6個月齡大鼠骨髓對各種造模方法最敏感，雖然文獻(xiàn)報道大鼠骨皮質(zhì)缺乏Haversian系統(tǒng)且重建率低[8]，但這不會對骨松質(zhì)中骨髓研究產(chǎn)生影響。

骨髓按其是否具有造血功能分為紅骨髓和黃骨髓，人體紅骨髓中脂肪組織∶水∶蛋白質(zhì)約為4∶4∶2，而黃骨髓中脂肪組織∶水∶蛋白質(zhì)約為8∶1.5∶0.5，骨髓脂肪酸包括飽和脂肪酸(29%～33%)、單不飽和脂肪酸(48%～58%)以及多不飽和脂肪酸(9%～20%)[9]。隨著年齡的增長，紅骨髓逐漸被黃骨髓取代，紅/黃骨髓比例呈下降趨勢，導(dǎo)致骨髓內(nèi)脂肪組織含量逐漸增加，尤其對于老年人群中絕經(jīng)后婦女，這種趨勢更加明顯，常常伴隨骨質(zhì)疏松[9-10]。隨著研究的進(jìn)一步深入，學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)不同的脂肪酸成分對骨骼代謝發(fā)揮著抗炎和毒性兩種截然不同的作用[11-12]。大鼠屬于哺乳動物，骨髓脂肪變化特點與人類相似，能很好地模擬人類骨代謝特征。因此，骨髓脂肪酸是評價骨髓疾病非常重要的生物學(xué)標(biāo)志物，臨床及動物研究急需影像學(xué)檢查手段解決活體無創(chuàng)評估骨髓脂肪含量以監(jiān)測骨髓疾病的發(fā)生、發(fā)展以及療效的問題。1H-MRS是一種無創(chuàng)性研究活體器官組織代謝、生化變化及化合物定量分析的一項技術(shù)，常用的包括PRESS和激勵回波探測法(stimulated-echo acquisition method，STEAM)，PRESS信噪比較高，對運動不太敏感，易于發(fā)現(xiàn)長T2的代謝物，而STEAM信噪比較低，對運動較敏感，易于發(fā)現(xiàn)短T2的代謝物。1H-MRS的空間定位技術(shù)分為單體素和多體素技術(shù)，以前者應(yīng)用最多。目前1H-MRS被廣泛接受用于量化骨髓脂肪酸，可以通過測定活體骨髓中水、脂兩峰的高度、峰底寬度以及半峰值的寬度等參數(shù)對脂肪酸進(jìn)行半定量分析，常用的指標(biāo)包括FF、脂水峰比(lipid water ratio，LWR)以及脂水峰線寬(line width，LW)，其中以FF最常用[5-7，13]。

目前國內(nèi)外利用單體素1H-MRS活體測定人類以及大中型動物骨髓脂肪含量的文獻(xiàn)較多，但尚未見利用臨床商用MRI儀對大鼠骨髓進(jìn)行1H-MRS研究的報道，主要原因是大鼠骨骼較小，無法采用單體素1H-MRS檢查[14]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，利用Siemens 3.0 T MRI儀對大鼠進(jìn)行1H-MRS檢查有一定的要求，即體重與骨骼的選擇，主要原因是所選骨骼的大小、形狀需滿足多體素PRESS掃描技術(shù)對最小體素塊(2.5 mm×2.5 mm×5 mm)的要求，經(jīng)過多次摸索，本研究最終確定選用體重不低于250 g的3月齡雌性SD大鼠的腰5椎體作為1H-MRS掃描對象，不僅所選大鼠月齡與最早的最佳造模時間(3～6個月)吻合，以此時間點為基線有助于更加全面觀察各種模型骨髓脂肪酸含量時序變化規(guī)律，而且所選椎體剛好滿足多體素PRESS最小體素塊對骨骼大小、形狀的要求，同時選用5 cm孔徑的大鼠專用線圈確保采集圖像的質(zhì)量。本研究測得的正常3月齡雌性大鼠腰5椎體的FF值較低，而骨質(zhì)疏松大鼠模型腰5椎體的FF值明顯增高，且與相應(yīng)病理觀察相符，初步說明了多體素PRESS技術(shù)測定大鼠椎體FF值的可行性，同時也為今后相關(guān)研究提供FF值參考。而且大鼠全身骨骼僅腰5、腰6椎體符合多體素波譜分析對形狀、大小的苛刻要求，但符合條件的體素塊在椎體內(nèi)移動的空間非常有限，因此測得的FF值非常穩(wěn)定，重復(fù)性理想，所獲取的1H-MRS圖像基線較平穩(wěn)，水峰與飽和脂肪酸主峰清晰可辨，形態(tài)正常，同時還能清晰顯示不飽和脂肪酸峰的變化，對今后進(jìn)行各種動物模型骨髓不同脂肪酸成分的1H-MRS分析提供了堅實的技術(shù)支持。

本研究的主要不足是大鼠數(shù)量較少以及未將雄性大鼠納入研究，統(tǒng)計結(jié)果可能受上述因素影響。另外，本研究僅觀察5只骨質(zhì)疏松模型大鼠的椎體1H-MRS的波譜特點，目的是與正常大鼠作大致比較，今后有待大樣本研究。

總之，本研究顯示，臨床商用3.0 T MRI掃描儀行1H-MRS檢查測定FF值評估大鼠椎體脂肪含量具備可行性，將為今后開展大鼠骨髓脂肪研究提供可靠的無創(chuàng)影像學(xué)檢測手段。