曾莎莎，梁延鵬,2，覃禮堂，莫凌云，曾鴻鵠,2,*

1. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 桂林 541004 2. 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點實驗室，桂林 541004 3. 巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，桂林 541004 4. 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點實驗室科教結(jié)合科技創(chuàng)新基地，桂林 541004

有機磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides, OPs)是指組分上含磷的有機農(nóng)藥，以具有高效、易降解和低殘留的特點在19世紀70年代取代了有機氯農(nóng)藥，在農(nóng)業(yè)中被廣泛施用[1]。OPs的大量生產(chǎn)和施用使得OPs通過地表徑流等過程成為水體中普遍存在的污染物。盡管水體中檢出的OPs可以被認為是以“無可見有害作用水平”的濃度存在，但是這些低濃度下存在的多種OPs的組合毒性效應(yīng)不可忽視[2]。OPs可通過抑制水生生物體內(nèi)重要酶的活性，導(dǎo)致水生生物的死亡[3]。OPs對膽堿酯酶的抑制作用勢必會對水環(huán)境中非靶標生物甚至人類的生存和健康產(chǎn)生威脅[4]。因此，亟需開展OPs對水生生物的聯(lián)合毒性研究。

目前，環(huán)境研究工作者針對OPs水生生物聯(lián)合毒性展開了系列研究，朱濤等[5]把Floater-Hormann插值法理論用于OPs對線蟲的聯(lián)合毒性的評估，結(jié)果顯示，敵敵畏與樂果的聯(lián)合作用不僅表現(xiàn)為加和作用，還在局部低濃度呈現(xiàn)拮抗作用；Zhang等[6]以青?；【鶴67為受試生物，考察馬拉硫磷等6種OPs的聯(lián)合效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)OPs的毒性相互作用多數(shù)服從加和作用；Zeng等[7]探究甲基對硫磷等5種OPs對大型溞的聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)OPs的聯(lián)合毒性可用濃度加和(CA)模型預(yù)測評估；戴家銀等[8]研究發(fā)現(xiàn)甲基異柳磷與甲胺磷對真鯛及平鯛幼體的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用；Tien等[9]發(fā)現(xiàn)毒死蜱、特丁硫磷和甲胺磷對當(dāng)?shù)睾恿鞣蛛x出的3種本土藻類的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用。以上研究主要集中于水生動物的聯(lián)合毒性，對標準藻類研究較少。復(fù)合污染物的聯(lián)合毒性相互作用(加和、協(xié)同和拮抗作用)受混合組分的影響，可能具有濃度水平依賴性[10-11]。這促使筆者系統(tǒng)思考OPs對淡水綠藻的聯(lián)合毒性效應(yīng)具有怎樣的變化規(guī)律，其混合物毒性及其毒性相互作用有無組分濃度水平依賴性。

綠藻作為淡水生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者及水生食物鏈的基本環(huán)節(jié)[12]，對淡水生態(tài)系統(tǒng)中綠藻的任何外源性干擾都可能導(dǎo)致整個水生態(tài)系統(tǒng)失衡。因此，開展污染物對淡水綠藻的毒性作用研究具有實際意義。蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)屬綠藻門，小球藻屬，是游離單細胞藻，因繁殖快、藻液分布均勻不易沉降、以及與污染物接觸充分等原因，成為水環(huán)境毒理學(xué)常用的標準試驗淡水綠藻種[13]。葛會林等[14]研究了有機磷與三嗪農(nóng)藥對斜生柵藻的聯(lián)合毒性，而有關(guān)5種OPs對C. pyrenoidosa的聯(lián)合毒性及毒性相互作用研究尚未見有報道。

因此，本研究以農(nóng)業(yè)中年使用量達1 000～30 000 t的5種OPs[15]：敵百蟲(trichlorfon, TRC)、馬拉硫磷(malathion, MIT)、敵敵畏(dichlorvos, DDVP)、氧樂果(omethoate, OMT)和樂果(dimethoate, DIT)為混合組分，以C. pyrenoidosa為受試生物，采用直接均分射線法設(shè)計二元混合物，測定OPs單一及混合物的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，以基于95%觀測置信區(qū)間(observation-based confidence interval, OCI)的組合指數(shù)(combination index, CI)法[16-17]探討OPs二元混合物在不同效應(yīng)水平下對C. pyrenoidosa的毒性相互作用規(guī)律，并初步分析OPs混合物的毒性特點，以期為科學(xué)評估OPs水生生態(tài)風(fēng)險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為OPs在農(nóng)業(yè)上的合理施用提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗藻種為蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)，購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB)，編號為FACHB-5。該藻采用BG11培養(yǎng)基，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中，于22 ℃、照度3 000 lx和光暗比12 h∶12 h條件下培養(yǎng)。實驗時采用處于對數(shù)生長期的藻。

5種OPs包括TRC、MIT、DDVP、OMT和DIT，純度均大于98%。TRC、DDVP和OMT購于德國的DrEhrenstorfer GmbH公司，MIT和DIT購于美國的CATO公司。5種OPs的基本信息見表1，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

1.2 毒性測試、曲線擬合及混合物設(shè)計

C. pyrenoidosa的毒性測定參照文獻[18]。生長抑制毒性表達為毒物對C. pyrenoidosa的生長抑制率I：

I=1-(ODt,i-ODt,0)/(OD0,i-OD0,0)

(1)

式中：ODt,i和ODt,0分別是實驗組96 h和0 h后藻液的光密度(OD)值；OD0,i和OD0,0分別是空白對照組96 h和0 h后藻液的OD值。

采用非線性函數(shù)Weibull擬合實驗數(shù)據(jù)，表達式如下：

y=1-exp(-exp(α+β×1og10(c)))

(2)

式中：α、β是函數(shù)的位置參數(shù)及斜率參數(shù)；y為效應(yīng)，即毒物對指示生物的抑制率；c為毒物的濃度。

OPs二元混合體系采用直接均分射線法(EquRay)設(shè)計，共9個混合物體系，每個OPs混合體系設(shè)置了5條混合射線，共45條混合射線[19]。各個混合射線包含的OPs組分及各組分的濃度比(pi)見表2。

1.3 毒性相互作用評估

本文用基于的95% OCI的組合指數(shù)(CI)探討OPs對C. pyrenoidosa的毒性相互作用。混合物濃度-效應(yīng)曲線的95% OCI定義如下[20]：

(3)

式中：y為濃度-效應(yīng)曲線(CRCs)擬合函數(shù)；α為顯著性水平(α = 0.05)；t為自由度(n-m)在置信水平為α下的臨界值，可由t分布表查；C為由非線性最小二乘回歸得到的參數(shù)估計值的協(xié)方差矩陣；s為觀測值標準偏差。

圖1 5種OPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 The chemical structure of five OPs

表1 5種有機磷農(nóng)藥(OPs)的理化性質(zhì)及其濃度-效應(yīng)曲線的Weibull擬合參數(shù)Table 1 Physicochemical properties and Weibull fitting parameters for concentration-effect curve of five organophosphorus pesticides (OPs)

注：pEC50為半數(shù)效應(yīng)濃度EC50的負對數(shù)值。

Note: pEC50refers to the negative logarithm of EC50value.

表2 OPs混合物對C. pyrenoidosa的Weibull擬合模型參數(shù)和毒性數(shù)據(jù)Table 2 Weibull fitting model parameters and toxicity data for OPs binary mixtures to C. pyrenoidosa

注： x%表示效應(yīng)水平；ADD表示加和作用，ANT表示拮抗作用。

Note: x% indicates effects level; ADD stands for additive action, ANT stands for antagonism.

設(shè)n個組分構(gòu)成的多元混合物在x%效應(yīng)下的混合物組合指數(shù)(CI)定義如下[21]：

(4)

式中：ECx,i是混合物中第i個組分單獨施用時產(chǎn)生x%效應(yīng)的濃度；pi是第i個組分在混合物中的濃度比；混合物實驗濃度(ECx,Obs)則通過Weibull反函數(shù)計算。

利用95% OCI的ECx,Obs的置信區(qū)間上限(ECx,Up)和下限(ECx,Low)替代式(4)中的ECx,Obs，獲得CI的置信區(qū)間上下限(CIUpper、CILower)：

(5)

(6)

通過對CI與95% OCI的綜合分析，在指定效應(yīng)下，CILower>1時為拮抗作用，CIUpper<1時為協(xié)同作用，CILower<1

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 5種OPs對C. pyrenoidosa的單一毒性

5種OPs對C. pyrenoidosa的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)均可通過Weibull函數(shù)擬合，其擬合模型參數(shù)(回歸參數(shù)α和β值，統(tǒng)計參數(shù)R2和RMSE)見表1，表中5種OPs的R2值均大于0.96且所有RMSE值均小于0.06，這表示了擬合質(zhì)量的可靠性。圖2則顯示了這5種OPs的濃度-效應(yīng)擬合曲線(CRCs)，呈經(jīng)典S型。以pEC50作為毒性指標，pEC50的數(shù)值越大，毒性越大[22]，則5種OPs對C. pyrenoidosa的毒性順序為：TRC(pEC50=3.89)>MIT(pEC50=3.77)>DDVP(pEC50= 3.63)>OMT(pEC50=3.44)>DIT(pEC50=3.27)。其毒性大小順序與浮游植物的結(jié)果大致相同[23]。

圖2 5種OPs對C. pyrenoidosa的濃度-效應(yīng)曲線(CRCs)注：圖中散點表示實測數(shù)據(jù)，實線表示擬合線；下同。Fig. 2 The concentration-response curves (CRCs) of five OPs to C. pyrenoidosa Note: Dispersed points and solid lines in the diagram refer to the observed data and fitted lines, respectively. The same below.

圖3 9組OPs二元混合物體系的各混合物射線對C. pyrenoidosa的擬合濃度-效應(yīng)曲線Fig. 3 The fitted concentration-effect curves of various rays in 9 groups of OPs binary mixtures to C. pyrenoidosa

2.2 OPs二元混合物對C. pyrenoidosa的聯(lián)合毒性

9組OPs二元混合體系共45條射線的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)可用Weibull函數(shù)有效擬合，其擬合模型參數(shù)(回歸參數(shù)α和β值，統(tǒng)計參數(shù)R2和RMSE)和每條射線的EC50及pEC50見表2，擬合CRCs繪于圖3。由表2得知，R2均大于0.95，RMSE均小于0.06，擬合效果顯著。大量污染物聯(lián)合毒性研究表明，混合物毒性具有混合組分濃度比依賴性是常見現(xiàn)象[25-26]。從圖3中可以看出，本研究除MIT-DIT、MIT-TRC、TRC-DIT、TRC-OMT和DDVP-DIT混合物體系的5條射線隨組分的濃度比有較明顯的變化外，其余4組OPs混合物體系的射線沒有完全分開甚至重疊，表明不同OPs混合物對C. pyrenoidosa的聯(lián)合毒性因組分的不同，有些混合物毒性具有組分濃度比依賴性，而某些混合物毒性則不存在組分濃度比依賴性。由于混合物毒性的復(fù)雜性，具體混合物中何種OPs存在可能使混合物毒性具有組分濃度比依賴性需要進一步研究。

2.3 OPs二元混合物的毒性相互作用

基于的95% OCI的CI法表征OPs混合物體系在5%～80%效應(yīng)水平內(nèi)對C. pyrenoidosa的毒性相互作用。圖4示例了產(chǎn)生比較明顯毒性相互作用的4組OPs混合體系的CI及OCI上下限隨效應(yīng)x%變化的曲線圖。從圖4可知，在MIT-DIT、MIT-OMT和MIT-DDVP混合體系中，不考慮95% OCI則整個效應(yīng)水平內(nèi)判斷為拮抗作用，綜合考慮95% OCI則低效應(yīng)區(qū)呈加和作用，高效應(yīng)區(qū)呈拮抗作用；MIT-TRC體系中，若不考慮95% OCI，射線R3(x%<50%)、R4(x%>20%)和R5(x%>15%)表現(xiàn)為協(xié)同作用，考慮95% OCI為加和作用，因此，在評估過程中有必要檢查CI的95% OCI對混合物毒理學(xué)相互作用的影響。

該4組混合體系均含有MIT，并且其拮抗作用隨MIT混合比的降低而逐漸過渡到加和作用，意味著表現(xiàn)出拮抗作用的4組混合體系中起決定性作用的是MIT，在對C. pyrenoidosa的致毒過程中MIT可能出現(xiàn)了不同的毒性效應(yīng)或者類似競爭作用位點的可結(jié)合性降低，因而減弱了對方的毒性。從圖中我們亦可以看出具有不同濃度比的不同混合射線具有不同的相互作用，不同效應(yīng)水平下的相同混合射線具有不同的相互作用，這表明OPs混合物毒性相互作用具有一定的組分濃度比依賴性，進一步證實了文獻中的研究結(jié)果[27-28]。

圖4 4組具有毒性相互作用OPs二元混合物基于95% OCI的CI圖注：● CI值；○ 95% OCI(95%觀測置信區(qū)間)； ▏為相互作用分界線；ADD為加和作用；ANT為拮抗作用。Fig. 4 Plot of combination index (CI) integrating with 95% observation-based confidence intervals (OCIs) vs. 4 sets of OPs binary mixtureNote: ● CI value; ○ 95% OCI; ▏Interaction boundary; ADD stands for additive effect; ANT stands for antagonism.

所有OPs混合射線的毒性相互作用總結(jié)于表2，9組混合體系中有28條射線呈經(jīng)典加和作用，17條射線呈部分加和，部分拮抗作用；發(fā)生拮抗作用的混合射線均具有低效應(yīng)水平區(qū)域呈加和作用，高效應(yīng)水平區(qū)域呈拮抗作用的規(guī)律。研究亦發(fā)現(xiàn)，具有毒性相互作用的MIT-OMT和MIT-DDVP混合體系的混合物毒性并沒有明顯的組分濃度比依賴性，混合毒性具有明顯組分濃度比依賴性的TRC-DIT和TRC-OMT混合體系，其毒性相互作用均為加和作用。這說明OPs混合物的毒性相互作用組分濃度比依賴性與其混合物毒性的組分濃度比依賴性規(guī)律互不干擾，具體情況需進一步研究。

綜上所述：

(1)根據(jù)單一毒性測試結(jié)果，本研究中5種OPs對C. pyrenoidosa的毒性差異不明顯，其毒性大小順序為：TRC(pEC50=3.89)>MIT(pEC50=3.77)>DDVP(pEC50=3.63)>OMT(pEC50=3.44)>DIT(pEC50=3.27)，OPs對C. pyrenoidosa的毒性大小受其中心磷原子的電正性影響。

(2)以基于95% OCI的CI法評估混合物毒性相互作用，OPs對C. pyrenoidosa的毒性相互作用以加和為主，部分發(fā)生拮抗作用，發(fā)生拮抗作用的混合射線具有低效應(yīng)呈加和作用、高效應(yīng)呈拮抗作用的規(guī)律；與MIT混合的體系均有發(fā)生拮抗作用，且MIT濃度比例越高，拮抗作用越強。

(3)OPs對C. pyrenoidosa的聯(lián)合毒性因混合組分不同，部分混合物毒性依賴于組分濃度水平；OPs混合物的毒性相互作用與組分濃度比相關(guān)；OPs混合物對C. pyrenoidosa的毒性相互作用與其混合物毒性兩者均存在的組分濃度比依賴性規(guī)律，且互不相關(guān)。