李敏，殷茂嬌，朱娟娟，馬海軍,*

1. 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021 2. 寧夏葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，銀川 750021

鹵代芳烴類化合物由于富含C—F、C—Cl和C—Br等高能化學(xué)鍵及一至數(shù)個(gè)芳香環(huán)，分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在土壤、水體等介質(zhì)中很難依靠自然自凈過程降解去除；近年來該類化合物在環(huán)境中廣泛分布、持久存在，并具有潛在的生物毒性風(fēng)險(xiǎn)，因此引起了巨大關(guān)注[1-2]。鹵代肉桂酸是一類鹵代芳烴類化合物，廣泛應(yīng)用于電子、醫(yī)藥、化妝品和除草劑等的生產(chǎn)。隨著使用量的增加，其進(jìn)入環(huán)境所帶來的潛在生態(tài)環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。但是，目前環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域?qū)u代肉桂酸類化合物的環(huán)境效應(yīng)，包括環(huán)境殘留水平、環(huán)境遷移轉(zhuǎn)化行為、生態(tài)毒理效應(yīng)和生物降解性能等相關(guān)研究十分匱乏，亟待填補(bǔ)[3-6]。

由于污染物種類繁多，對每一個(gè)化合物采用實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行毒性測試是難以實(shí)現(xiàn)的。定量結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)研究(quantitative structure-activity relationship, QSAR)為此類問題的解決提供了一個(gè)有效途徑，其旨在對部分有機(jī)化合物的生物毒性數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)建模，進(jìn)而預(yù)測其他結(jié)構(gòu)類似化合物的生物毒性；研究結(jié)果可為環(huán)境中有機(jī)污染物的風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)、揭示致毒機(jī)制等提供理論參考[7-8]，是當(dāng)今藥物化學(xué)、環(huán)境化學(xué)及計(jì)算機(jī)化學(xué)等領(lǐng)域的一個(gè)前沿課題[9-10]。

羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)是淡水水體中的常見藻類，對污染脅迫十分敏感，常作為經(jīng)典水生毒理學(xué)受試生物應(yīng)用于污染物和化學(xué)品的毒理研究[11]。因此，本文考察常見14種鹵代肉桂酸化合物對羊角月牙藻的生長抑制作用，并利用3D-QSAR中比較分子場分析法(comparative molecular field analysis, CoMFA)和比較分子相似性指數(shù)法(comparative molecular similarity index analysis, CoMSIA)，揭示該類化合物分子結(jié)構(gòu)與其毒性效應(yīng)之間的內(nèi)在關(guān)系，為鹵代肉桂酸類化合物生態(tài)環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羊角月牙藻購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、14種鹵代肉桂酸類化合物(種類見表1)購自阿拉丁試劑(中國，上海)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 藻種培養(yǎng)及急性毒性測試

藻種培養(yǎng)基選擇BG11(Blue-Green Medium)人工培養(yǎng)液。羊角月牙藻藻種轉(zhuǎn)到BG11人工培養(yǎng)液后，放入溫度為(25±1) ℃、光暗比為12 h∶12 h、光強(qiáng)為2 000 lux、轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的立式光照搖床培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)，隔96 h移種一次，反復(fù)3～5次，使藻類達(dá)到同步生長階段，以此作為實(shí)驗(yàn)藻種。

準(zhǔn)確稱取鹵代肉桂酸化合物100 mg(0.10 g，稱量范圍0.095～0.105 g)，用DMSO溶解并定容至10 mL容量瓶，獲得10 mg·mL-1高濃度母液。取少量對數(shù)生長期的藻種用培養(yǎng)基稀釋后，獲得初始藻液密度約為104個(gè)·mL-1的試驗(yàn)藻液。取試驗(yàn)藻液50 mL于250 mL錐形瓶中，分別加入一定體積10 mg·mL-1鹵代肉桂酸高濃度母液，每個(gè)化合物在0～100 mg·L-1濃度范圍內(nèi)按一定間隔獲得5～7個(gè)濃度梯度；同時(shí)設(shè)立DMSO溶劑對照組，每個(gè)處理3個(gè)平行。培養(yǎng)條件與藻種的擴(kuò)大培養(yǎng)條件一致。采用顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)方法建立羊角月牙藻細(xì)胞密度(個(gè)·mL-1)與藻液光密度OD680之間的相關(guān)關(guān)系。分別于0、24、48和72 h測定各樣品OD680值，換算成藻液細(xì)胞密度后，根據(jù)公式(1)計(jì)算抑制率[12-13]。

抑制率(%) = (1-N/N0)×100%

(1)

式中：N為樣品處理組細(xì)胞數(shù)，N0為空白對照細(xì)胞數(shù)。

在獲得不同濃度鹵代肉桂酸對藻生長抑制率的基礎(chǔ)上，采用概率單位回歸法計(jì)算各化合物對羊角月牙藻的72 h-EC50值。

1.3 三維定量構(gòu)效關(guān)系建模

定量構(gòu)效關(guān)系建模分析中，生物活性數(shù)值采用以摩爾濃度單位計(jì)的EC50(μmol·L-1)數(shù)值，具體見表1。利用CoMFA和CoMSIA方法進(jìn)行3D-QSAR分析，所有操作均采用SYBYL7.0軟件各模塊完成。化合物分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化使用Tripos力場，分子電荷采用Gasteiger-Huckel電荷，能量最小化計(jì)算過程中，將Max.Iterations增加到1 000，Gradient減低為0.005，Color Option設(shè)為Force。采用4-氯肉桂酸為模板，使用Align Database方法將所有分子進(jìn)行疊合。其疊合效果如圖1所示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用偏最小二乘(partial least squares analysis, PLS)方法建立模型，采用去一法(leave-one-out, LOO)進(jìn)行交叉驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 鹵代肉桂酸對羊角月牙藻毒性的劑量效應(yīng)

14種鹵代肉桂酸類化合物對羊角月牙藻的生長毒性作用測定結(jié)果如表1所示，結(jié)果顯示，在0～100 mg·L-1濃度范圍內(nèi)上述化合物均對羊角月牙藻產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)，且濃度越大，毒性越強(qiáng)。其中，4-氯、4-溴肉桂酸對羊角月牙藻的毒性最強(qiáng)，其72 h-EC50值分別為45.88和49.79 mg·L-1，2,4-二氟肉桂酸對羊角月牙藻的毒性最弱。

本次研究囊括的化合物，以肉桂酸為母核結(jié)構(gòu)，苯環(huán)上不同取代位點(diǎn)和不同取代基類型(鹵素原子種類)構(gòu)成了分子結(jié)構(gòu)的多樣性，各化合物對羊角月牙藻的生長抑制效應(yīng)也表現(xiàn)出一定差異。因此，采用CoMFA及CoMSIA方法對鹵代肉桂酸抑制羊角月牙藻生長的毒性效應(yīng)與分子結(jié)構(gòu)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)的分析。

2.2 鹵代肉桂酸對羊角月牙藻毒性的定量構(gòu)效關(guān)系

2.2.1 CoMFA及CoMSIA建模統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

經(jīng)多次嘗試，構(gòu)建最優(yōu)的CoMFA模型統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)如表2所示。CoMFA模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)Q2為0.804，最佳主成分?jǐn)?shù)為3，表明獲得的模型具有良好的自身一致性；在95%置信度水平進(jìn)行非交互驗(yàn)證，得到模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.942，標(biāo)準(zhǔn)偏差SEE為18.54，F(xiàn)值為54.54，以上參數(shù)表明所建模型具有良好的擬合能力和預(yù)測能力[14]，模型對14種化合物的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值的關(guān)系見圖2(a)，線性擬合相關(guān)系數(shù)為0.9692。立體場與靜電場的貢獻(xiàn)值分別為63.3%和36.7%，說明鹵代肉桂酸化合物分子立體場和靜電場特性均對毒性大小產(chǎn)生影響，其中立體場貢獻(xiàn)更大。

考慮到分子的立體特性與其疏水特性聯(lián)系密切，且鹵代肉桂酸化合物結(jié)構(gòu)中存在羥基、羧基等多種氫鍵供體和受體官能團(tuán)，分子氫鍵供體和受體特性對生物毒性效應(yīng)的影響值得探究。因此，本研究進(jìn)一步采用CoMSIA方法進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系建模分析。獲得的CoMSIA Ⅰ及CoMSIA Ⅱ模型統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)如表2所示。

CoMSIA Ⅰ模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)Q2為0.668，最佳主成分?jǐn)?shù)為5；非交互驗(yàn)證得到模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.969，標(biāo)準(zhǔn)偏差SEE為15.25，F(xiàn)值為49.74，靜電場、疏水場、立體場、氫鍵供體及受體場均有貢獻(xiàn)，其中前兩者起主要作用；計(jì)算發(fā)現(xiàn)，若僅考慮靜電場和疏水場，建立的CoMSIA Ⅱ模型Q2和F值略有下降，分別為0.655和30.07，但R2提高至0.990，靜電場與疏水場的貢獻(xiàn)值分別為62.2%和37.8%，CoMSIA Ⅱ模型實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值的關(guān)系見圖2(b)，線性擬合相關(guān)系數(shù)為0.9685。

2.2.2 CoMFA及CoMSIA三維等高圖分析

CoMFA模型三維等高圖如圖3所示，其非常直觀地顯示出分子結(jié)構(gòu)立體性質(zhì)和靜電性質(zhì)對毒性大小的影響。其中，在立體場中，綠色表示增大基團(tuán)體積會(huì)導(dǎo)致毒性增強(qiáng)，黃色表示減小基團(tuán)體積會(huì)導(dǎo)致毒性增強(qiáng)；在靜電場中，紅色表示增加帶負(fù)電基團(tuán)會(huì)導(dǎo)致毒性增強(qiáng)，藍(lán)色表示增加帶正電基團(tuán)會(huì)導(dǎo)致毒性增強(qiáng)。

在CoMFA模型的立體場中，苯環(huán)上3、4號位點(diǎn)附近出現(xiàn)大面積的綠色色塊，代表在上述位置存在大體積取代基會(huì)增強(qiáng)鹵代肉桂酸化合物對羊角月牙藻的毒性效應(yīng)。對比3-氯肉桂酸和3-溴肉桂酸72 h-EC50值發(fā)現(xiàn)，隨著3位取代鹵素原子體積的增加，其對羊角月牙藻的毒性作用增強(qiáng)。4-氟、4-氯和4-溴肉桂酸3種化合物對羊角月牙藻的毒性效應(yīng)，同樣隨著鹵素原子半徑的增大而增強(qiáng)；此外，2-氟肉桂酸與4-溴-2-氟肉桂酸、4-氟肉桂酸與4-三氟甲基肉桂酸，這2組化合物均表現(xiàn)出隨著4位取代基體積增大，毒性作用增強(qiáng)的趨勢。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CoMFA立體場等勢圖顯示的結(jié)果完全一致。

在CoMFA模型的靜電場中，苯環(huán)母核上覆蓋了大面積的藍(lán)色色塊，代表苯環(huán)上取代基電負(fù)性越小，化合物對羊角月牙藻的毒性越大。鹵素原子電負(fù)性排序?yàn)镕>Cl>Br，4-氟、4-氯和4-溴肉桂酸3種化合物毒性作用隨著鹵素原子電負(fù)性降低而增強(qiáng)；2-氟與2-氯肉桂酸、3-氯與3-溴肉桂酸2組化合物同樣符合上述規(guī)律。

CoMSIAⅡ模型三維等高圖如圖4所示。圖4(a)與圖3(b)結(jié)果相比，重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)苯環(huán)2、3號位點(diǎn)取代基電負(fù)性越小，化合物毒性效應(yīng)越強(qiáng)。CoMSIA Ⅱ模型疏水場如圖4(b)所示。在疏水場中，黃色表示增加疏水性基團(tuán)導(dǎo)致毒性增大，白色表示增加親水性基團(tuán)導(dǎo)致毒性增大。苯環(huán)母核3、4和6號位點(diǎn)附近覆蓋了大面積的黃色色塊，表明在上述位點(diǎn)增加疏水性取代基會(huì)導(dǎo)致鹵代肉桂酸毒性增強(qiáng)。鹵素是常見的憎水基團(tuán)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在肉桂酸分子中引入鹵素，尤其是氯或者溴，將增加化合物對羊角月牙藻的毒性。

表1 鹵代肉桂酸對羊角月牙藻毒性的實(shí)驗(yàn)值與模型分析值Table 1 The experimental and model-predicted values of halogenated cinnamic acids on the growth of Selenastrum capricornutum

注： CoMFA表示比較分子場分析法，CoMSIA表示比較分子相似性指數(shù)法。

Note: CoMFA stands for comparative molecular field analysis; CoMSIA stands for comparative molecular similarity index analysis; Exp. stands for experimental values; Pred. stands for predicted values; Res. stands for residual values.

圖1 14種鹵代肉桂酸類化合物分子疊合圖Fig. 1 Molecular overlap diagram of 14 halogenated cinnamic acids

3 討論(Discussion)

鹵代苯酚、鹵代苯甲酸等化合物與鹵代肉桂酸在結(jié)構(gòu)上具有一定類似性，已有研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸和單鹵代苯甲酸對羊角月牙藻的48-h EC50分別為83.29、13.48～83.11mg·L-1，即在苯環(huán)結(jié)構(gòu)上增加鹵素原子取代基，將導(dǎo)致該類化合物對羊角月牙藻的毒性增強(qiáng)[15]；苯酚、一氯代苯酚和多氯代苯酚對羊角月牙藻的72 h-EC50分別為197、11.5～51.8和2.10～16.1 mg·L-1，表明隨著苯環(huán)上氯原子數(shù)量的增多，該類化合物的毒性效應(yīng)呈較顯著的增加趨勢[16]。本研究結(jié)果顯示，肉桂酸和鹵代肉桂酸對羊角月牙藻的72 h-EC50分別為55.70、45.88～83.72 mg·L-1，毒性大小與類似污染物基本處在同一水平，但苯環(huán)上增加鹵素原子取代基后并未導(dǎo)致毒性顯著增強(qiáng)。參照國標(biāo)藻類生長抑制試驗(yàn)中農(nóng)藥對藻類毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)[17]，鹵代肉桂酸類化合物對羊角月牙藻的毒性屬于低毒范圍(72 h-EC50>3.0 mg·L-1)。目前，還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道鹵代肉桂酸類化合物在自然環(huán)境中的分布情況及殘留水平，但從其對羊角月牙藻的低毒性效應(yīng)來看，其對水環(huán)境中浮游藻類生長的危害較小。但是該結(jié)論僅限于72 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其長期毒性試驗(yàn)、其他毒性效應(yīng)及風(fēng)險(xiǎn)評估還需進(jìn)一步研究和完善。

圖2 生物毒性預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值關(guān)系圖Fig. 2 The relation schema of biological toxicity between predicted values and experimental values

圖3 CoMFA模型三維等勢圖Fig. 3 Contour maps of CoMFA model

圖4 CoMSIA Ⅱ模型三維等勢圖Fig. 4 Contour maps of CoMSIA Ⅱ model

表2 模型的偏最小二乘法分析結(jié)果Table 2 Partial least squares (PLS) results of the models in this study

本研究采用3D-QSAR方法定量分析鹵代肉桂酸對羊角月牙藻的毒性效應(yīng)，獲得CoMFA模型Q2=0.804，R2=0.942；CoMSIA Ⅱ模型的Q2=0.655，R2=0.990。其中，分子結(jié)構(gòu)中靜電場、立體場和疏水場對毒性效應(yīng)的影響較大。利用CoMFA和CoMSIA模型的等高圖可以在一定程度上探討化合物的致毒機(jī)制[18-19]。分子水平的致毒作用機(jī)制一般分為特異型和非特異型兩大類；其中，特異型指化合物分子結(jié)構(gòu)中存在反應(yīng)性的取代基團(tuán)，容易同酶、蛋白質(zhì)等生物受體分子發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)；而非特異型機(jī)制指結(jié)構(gòu)類似的分子能夠產(chǎn)生性質(zhì)類似的生物反應(yīng)，且反應(yīng)過程對特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)的依賴較弱，主要控制因素為化學(xué)分子在生物體和水相的分配比例，即分子的疏水性[20-23]。一般而言，分子的疏水性與立體場存在較大聯(lián)系。本研究CoMFA與CoMSIA Ⅱ模型中，立體場和疏水場貢獻(xiàn)率分別占比63.3%和37.8%，提示鹵代肉桂酸類化合物致毒作用中非特異型反應(yīng)占較大比重。眾多有機(jī)化合物對羊角月牙藻急性毒性的QSAR研究表明，分子的疏水特性是表征化合物毒性大小的重要參數(shù)[24-25]，本研究結(jié)果與之一致。本研究也嘗試應(yīng)用CoMSIA方法將分子的氫鍵供體和受體性質(zhì)納入考察范圍，發(fā)現(xiàn)上述2種參數(shù)對構(gòu)效關(guān)系貢獻(xiàn)值非常小，進(jìn)一步提示非特異型反應(yīng)占比較大。然而，不論是CoMFA還是CoMSIA Ⅱ模型，靜電場均有較大貢獻(xiàn)，分別占比36.7%和62.2%，據(jù)此推測在暴露過程中藻體與鹵代肉桂酸分子之間可能存在電子轉(zhuǎn)移。此外，鹵代肉桂酸類化合物苯環(huán)1號位上具有共同的取代基丙烯酸，其對化合物毒性的作用不容忽視；由于本研究考察的14種化合物在苯環(huán)1號位上無差別，因此丙烯酸基的作用無法探究，有待進(jìn)一步揭示。

綜上所述，通過對14種鹵代肉桂酸類化合物的羊角月牙藻急性毒性檢測和定量構(gòu)效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)該類化合物具有一定的急性毒性效應(yīng)，72 h-EC50值在幾十mg·L-1水平，其若長期排放或大量殘留則可能導(dǎo)致一定生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。將該類化合物對羊角月牙藻的毒性值分別與CoMFA和CoMSIA值進(jìn)行PLS分析，獲得了穩(wěn)健可靠的3D-QSAR模型；定量構(gòu)效關(guān)系表明分子結(jié)構(gòu)立體場、疏水場和靜電場性質(zhì)對毒性效應(yīng)影響顯著，在分子苯環(huán)結(jié)構(gòu)上引入體積較大、電負(fù)性較小及疏水性較強(qiáng)的取代基，將導(dǎo)致毒性升高。

致謝：感謝中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心杜宇國和魏東斌研究員研究團(tuán)隊(duì)給予SYBYL軟件平臺的支持和在建模過程中的指導(dǎo)幫助！