王滔，張瑾，卞志強，姜慧，申慧彥

安徽建筑大學環(huán)境與能源工程學院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥 230601

抗生素通常用于治療和預防人類和動物的致命感染[1]，但抗生素不能完全被機體吸收，大約有20%～75%會通過糞便或代謝產(chǎn)物排出[2]。由于去除抗生素的水處理工藝尚不完善，城市污水處理廠成為向環(huán)境排放抗生素的主要源頭[3]。進入水體的抗生素不僅污染環(huán)境，而且會對水生生物的生存甚至人類的健康構(gòu)成潛在的威脅。據(jù)文獻報道，環(huán)境中有的抗生素具有較強的生物毒性，有的抗生素殘留會誘導出耐藥細菌，甚至通過食物鏈的傳遞作用最終在人體內(nèi)積累并產(chǎn)生危害[4-6]。氨基糖苷類抗生素是一種價廉、高效的廣譜性殺菌劑，對嚴重的細菌感染尤其有效，在世界范圍內(nèi)得到廣泛使用，導致其在環(huán)境中的大量殘留，引起了人們的普遍關(guān)注[7-8]。

重金屬是環(huán)境中另一類典型的污染物，越來越受到全球尺度的特別關(guān)注[9]。重金屬污染物通過各種自然和人為來源被引入水體環(huán)境，包括家庭排放以及采礦和冶煉等工業(yè)排放[10]。由于重金屬是不可生物降解的持久性污染物，容易在生物體中積累，對生態(tài)系統(tǒng)甚至人類健康構(gòu)成威脅[11]，如重金屬鋅，因其在日常生產(chǎn)和生活中的廣泛應用而進入水體環(huán)境中，成為環(huán)境污染物，水生生物對其具有很強的吸附能力，且容易在生物體內(nèi)富集，當濃度過高時會造成生物組織氧化損傷[12]。然而，污染物在環(huán)境中不是以單個物質(zhì)的形式存在，而是以各種形式和濃度共存，不同組分間可能產(chǎn)生累積與聯(lián)合毒性作用，且隨著暴露時間的延長，其潛在的環(huán)境風險可能會更大[13]。目前有很多關(guān)于重金屬或抗生素單一污染物對生物毒性效應的研究，但很少有兩者聯(lián)合毒性作用動態(tài)變化規(guī)律的研究[14]。

關(guān)于污染物聯(lián)合毒性作用，早期使用的評估方法主要包括等效線圖法、混合毒性指數(shù)法和相似性參數(shù)法等[15-16]。這些傳統(tǒng)方法多采用等毒性濃度設計混合物，考察濃度范圍單一，具有較大局限性。在2000年時，德國不來梅大學的學者利用非線性函數(shù)模擬劑量-效應曲線，用回歸方法計算低效應濃度，并將濃度加和(concentration addtion, CA)與獨立作用(independent action, IA)模型應用于多元混合物濃度-效應的預測[17]，此后污染物聯(lián)合毒性相互作用的研究進入了新時期。CA和IA模型應用也越來越廣泛，一般情況下，CA模型適用于具有相似毒作用模式/作用機制(mode/mechanism of toxic action, MOA)污染物的混合物毒性評估，而IA模型適用于具有相異MOA污染物的混合物毒性評估[18]。但對于大多數(shù)污染物，其生物毒性作用機理不是完全清楚，越來越多的學者在進行混合物毒性評估時，同時使用2種模型，然后選擇較合適的模型。也有學者只采用其中一種模型(CA模型更為常用)評估混合毒性作用。然而，文獻中同時將2種模型CA和IA用于評估具有時間依賴特征的污染物間聯(lián)合毒性作用的研究較少[19-20]。

鑒于此，本研究擬以3種氨基糖苷類抗生素和重金屬鋅為研究對象，以蛋白核小球藻為測試生物，采用直接均分射線法[21]設計抗生素和重金屬不同濃度配比的代表性混合物，應用時間毒性微板分析法[22]系統(tǒng)測定單個污染物及其混合物在不同暴露時間的毒性，應用CA與IA模型評估在不同暴露時間的混合物毒性相互作用，揭示抗生素和重金屬混合污染物毒性相互作用隨時間變化規(guī)律，并比較2種模型預測結(jié)果的異同，以期為科學評價抗生素與重金屬混合物的環(huán)境風險提供數(shù)據(jù)和方法參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

3種氨基糖苷類抗生素包括硫酸安普霉素(apramycin sulfate, APR)、雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin sulfate, DIH)和硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate, STS)，均購自上海原葉生物科技有限公司，其理化性質(zhì)列于表1中。重金屬選擇氯化鋅化合物，購自國藥集團化學試劑有限公司，其理化性質(zhì)列于表1中。測試藥品儲備液用超純水配制，并于4 ℃冰箱中保存、備用。

Synergy 2 Multi-Mode多功能酶標儀(美國BioTek伯騰儀器有限公司)，YXQ-LS-100S11立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，MGC-250智能型光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 藻種與培養(yǎng)

實驗藻種：蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，編號為FACHB-5。C. pyrenoidosa的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)過程見參考文獻[23]。

1.3 時間毒性測定與數(shù)據(jù)擬合

微板設計與時間毒性的測定方法見參考文獻[23]，污染物及其混合物對蛋白核小球藻在不同暴露時間的生長抑制率按如下公式進行計算[23]：

Ei,j=(1-μi,j/μ0,j)×100%

(1)

式中：Ei,j為污染物在暴露時間j(j = 12, 24, 48,72, 96 h)對C. pyrenoidosa的生長抑制率；μi,j為ci微孔中C. pyrenoidosa在暴露時間j時的平均生長速率；μ0,j為微板中空白藻在暴露時間j時的平均生長速率[24]。

對各個污染物及其混合物在不同暴露時間的濃度-抑制率數(shù)據(jù)進行非線性擬合的兩參數(shù)函數(shù)Logit公式[23]：

E=1/[1+exp(-α-β×lgc)]

(2)

式中：E表示效應；c表示單個化合物或混合物的濃度；α和β分別為位置和斜率參數(shù)。

1.4 混合物實驗設計

為系統(tǒng)考察二元混合物毒性隨時間和濃度的變化規(guī)律，采用直接均分射線法(Equ-Ray)設計3個二元混合物體系，每個體系有5條濃度比不同的射線[25]，每條混合物射線的組分及其濃度比(pi)列于表2中。

表1 3種抗生素與重金屬鋅的理化性質(zhì)Table 1 Physiochemical properties of three antibiotics and one heavy metal Zn

表2 3組二元混合物體系的組分及其濃度比(pi)Table 2 The components and their concentration ratios (pi) of three binary mixture systems

1.5 混合物毒性相互作用分析

CA和IA模型是混合物毒性評估中常用的加和參考模型，計算公式見(3)和(4)[26-28]，如果混合物的觀測毒性等于、大于或小于預測毒性，則混合物毒性相互作用分別為加和作用、協(xié)同作用或拮抗作用。

CA模型數(shù)學表達式為：

(3)

IA模型數(shù)學表達式為：

(4)

式中：ci表示混合物中產(chǎn)生某一效應x%時組分i的濃度，ECx,i表示混合物中第i個化合物單獨存在時產(chǎn)生效應x%時的濃度。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素和重金屬鋅對C. pyrenoidosa的時間毒性

Logit非線性函數(shù)能較好擬合污染物及其混合物對C. pyrenoidosa的濃度-效應數(shù)據(jù)[29]。應用t-MTA方法測定不同暴露時間時濃度-效應數(shù)據(jù)，并將擬合的濃度-效應曲線(CRC)繪于圖1。從圖1可以看出，3種抗生素對C. pyrenoidosa的毒性具有明顯的時間依賴性，即在開始的12 h，3種抗生素對C. pyrenoidosa基本無毒性，隨著暴露時間延長，毒性逐漸增加，在72 h后增幅變緩。而鋅對C. pyrenoidosa的時間依賴毒性不如抗生素明顯，在12 h就達到50%以上的抑制率。

圖1 3種抗生素和Zn在不同暴露時間對蛋白核小球藻的濃度-效應曲線Fig. 1 The concentration-effect curves of three antibiotics and Zn in different time toward C. pyrenoidosa

為了比較抗生素對C. pyrenoidosa在不同暴露時間的毒性大小(通常以半數(shù)效應濃度的負對數(shù)pEC50表示)，以時間為X軸，pEC50為Y軸作圖，4種物質(zhì)在0～96 h內(nèi)的pEC50值變化曲線如圖2所示。從圖2可以更明顯地看出4種物質(zhì)pEC50值隨暴露時間的延長而增大，但不同物質(zhì)的pEC50值隨時間變化的規(guī)律稍有不同，如Zn的pEC50值隨時間的延長，在緩慢增加，而抗生素APR和STS在0～48 h內(nèi)抑制率低于50%，但48 h后pEC50值迅速增加，然后增速減慢。抗生素DIH在0～72 h也達不到50%的抑制率，在72 h后pEC50值迅速增加，甚至超過APR和Zn的pEC50值?？梢姡?種物質(zhì)的毒性隨暴露時間的變化而發(fā)生變化，但不同物質(zhì)變化的規(guī)律不同。以pEC50值為毒性大小的判斷依據(jù)，則在暴露時間節(jié)點12 h和24 h，只有Zn有毒性，pEC50值分別為2.503和2.706；在暴露時間節(jié)點48 h，除抗生素DIH沒有毒性，其他都呈現(xiàn)出一定的毒性，其毒性大小順序為：STS>APR>Zn；在暴露時間72 h和96 h，4種污染物毒性大小順序均為：STS>DIH>APR>Zn。結(jié)果表明，暴露時間也是污染物的生物毒性的重要影響因素，因此，只有系統(tǒng)考察濃度與時間2個因素，才能比較客觀和全面地了解污染物的生物毒性效應，才能更深入地了解污染物的毒理作用機制與途徑，提高生態(tài)風險評估的可靠性。

圖2 3種抗生素和Zn的pEC50值隨時間變化曲線Fig. 2 The changing curves of pEC50 values of three antibiotics and Zn with time

2.2 抗生素-重金屬鋅的二元混合物對C. pyrenoidosa的時間毒性

抗生素與重金屬二元混合物對蛋白核小球藻的濃度-效應數(shù)據(jù)點及其擬合結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出，3個混合物體系中的每條混合物射線對C. pyrenoidosa也具有明顯的時間依賴毒性。結(jié)合表2，可看出抗生素與鋅二元混合物體系的射線R1到R5，Zn的濃度比逐漸減小，抗生素的濃度比逐漸增加，混合物體系中射線的毒性隨時間的依賴性也逐漸明晰，這可能是由于抗生素對蛋白核小球藻具有明顯的時間依賴毒性。

圖3 3個混合物體系在不同暴露時間對蛋白核小球藻的濃度-效應曲線Fig. 3 The concentration-effect curves of three mixture systems in different time toward C. pyrenoidosa

圖4是3組混合物體系中各射線的pEC50值隨時間的變化圖。從圖4可知，各組混合物射線的pEC50值隨暴露時間的延長逐漸增加，但具有不同濃度比射線的pEC50值隨時間變化的規(guī)律稍有不同，如在Zn-APR混合物體系中，射線R1、R2和R3在暴露時間12 h就達到50%的抑制效應，pEC50值從暴露時間12 h開始，隨時間的延長而逐漸增加，72 h后不再增加，而R4和R5則在48 h之后才達到50%的抑制效應，然后隨時間延長逐漸增加；在Zn-DIH混合物體系中，射線R1和R2在暴露時間12 h就達到50%的抑制率，隨時間的延長而逐漸增加，96 h后不再增加，R3和R4則在24 h之后才達到50%的抑制效應，然后隨時間延長逐漸增加，R5則在48 h之后才達到50%的抑制效應；在Zn-STS混合物體系中，射線R1和R2的pEC50值從暴露時間12 h就開始隨時間的延長而逐漸增加，而R3、R4和R5則在24 h之后才達到50%的抑制效應，然后隨時間延長逐漸增加。對于Zn-DIH和Zn-STS這2個混合物體系，在96 h時各條射線的毒性大小順序均為R5>R4>R3>R2>R1，結(jié)合表2可知，混合物毒性隨組分中抗生素濃度比的增加而增加，具有明顯的組分濃度比依賴毒性，Zhang等[30]也發(fā)現(xiàn)了混合污染物毒性與其組分的濃度配比有關(guān)。

2.3 抗生素與重金屬鋅之間的時間依賴毒性相互作用

應用CA和IA模型對Zn-APR、Zn-DIH和Zn-STS這3組混合物體系的15條射線進行毒性相互作用分析，結(jié)果見圖5。由于3個混合物體系的射線中，有的呈現(xiàn)協(xié)同作用，有的呈加和作用，但3個混合物體系中的5條射線的協(xié)同作用隨暴露時間延長的變化規(guī)律相似，因此，圖5給出3個混合物體系中各自具有代表性的混合物射線的實驗觀測值及其95%置信區(qū)間(observed confident interval, OCI)、擬合曲線以及CA和IA預測結(jié)果。

從圖5可以看出，部分射線的CA和IA預測曲線位于實驗觀測置信區(qū)間下方，表現(xiàn)為協(xié)同作用，其余射線的CA和IA預測曲線位于實驗觀測置信區(qū)間內(nèi)，表現(xiàn)為加和作用。但在不同混合物體系中，毒性相互作用發(fā)生的濃度區(qū)域不同，如Zn-APR和Zn-DIH混合物體系中協(xié)同作用主要發(fā)生在較高濃度區(qū)域，而Zn-STS混合物體系中加和作用發(fā)生在整個濃度區(qū)域，這表明毒性相互作用類型與混合物的濃度有關(guān)。

圖5還顯示，混合物體系在不同暴露時間的協(xié)同作用強度不同，Zn-APR和Zn-DIH這2個混合物體系具有相似的規(guī)律。在12 h到24 h期間，隨著暴露時間延長，協(xié)同作用逐漸增強。在24 h到48 h期間，協(xié)同作用逐漸減弱，48 h后逐漸向加和作用轉(zhuǎn)變。

圖4 3個混合物體系的pEC50值隨時間變化圖Fig. 4 The changing of pEC50 values with the time for three mixture systems

圖5 3個Zn-抗生素混合物體系代表性射線的實驗觀測點及其95%置信區(qū)間、擬合濃度-效應曲線(CRC)以及CA和IA預測曲線注：圖中分散點(·)表示實驗點，實線(—)為擬合線，紅色短斷線(---)為CA預測曲線，黑色虛點點線(--)為IA預測曲線，藍色虛點線(--)為95%置信區(qū)間。Fig. 5 The observed concentration-effect data with 95% confidential intervals, fitted concentration response curve (CRC) and predicted curve by CA and IA of representative ray of three Zn-antibiotics mixture systemsNote: black dispersed point (·), solid line (—), red short dash line (---), black dash dot dot line (--), blue dash dot line (--) refer to the observed data, the fitted line, predicted curve by CA, predicted curve by IA and 95% confidential interval.

這表明協(xié)同作用強度隨暴露時間的變化而變化，即與暴露時間有關(guān)。

綜上所述，3組抗生素和重金屬的二元混合物體系對蛋白核小球藻的毒性具有明顯的濃度和時間依賴性，因此，在進行污染物生態(tài)毒性評估時，需要考慮時間和濃度2個因素，才能深入了解組分間相互作用機制，從而更準確地評估生態(tài)風險。

2.4 2種經(jīng)典模型對聯(lián)合毒性的評估比較

通過比較CA和IA預測線與實驗觀測值之間的位置關(guān)系，并分析混合物體系在不同暴露時間和不同濃度區(qū)域的毒性相互作用，發(fā)現(xiàn)Zn-APR與Zn-DIH二元混合物體系的毒性相互作用變化具有相似的規(guī)律。在低濃度區(qū)域，CA和IA預測線始終位于實驗觀測OCI內(nèi)，呈現(xiàn)出加和作用。在中濃度和高濃度區(qū)域內(nèi)，CA和IA預測曲線在開始暴露的時候位于實驗OCI下方，并隨暴露時間延長逐漸向?qū)嶒濷CI靠近，96 h的CA預測線在高濃度區(qū)域時位于實驗OCI下方，中濃度區(qū)域時位于實驗OCI內(nèi)，而IA預測線整體位于OCI內(nèi)；這2個混合物體系使用CA與IA模型可以得到不同的結(jié)果，比較IA預測線與觀測值的擬合CRCs，可知毒性相互作用從協(xié)同作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧雍妥饔?，而比較CA預測線與觀測值的擬合CRCs，可知中濃度區(qū)域的毒性相互作用始終呈現(xiàn)協(xié)同作用，高濃度區(qū)域的毒性相互作用從協(xié)同作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧雍妥饔?。對于Zn-STS二元混合物體系，在24 h，中濃度區(qū)域的CA和IA預測曲線同時位于實驗OCI下方，呈現(xiàn)出協(xié)同作用；而在其他時間和濃度區(qū)域內(nèi)，預測線均位于實驗OCI內(nèi)，呈現(xiàn)出加和作用。以上結(jié)果表明2種模型對抗生素和重金屬的二元混合物毒性評估結(jié)果除在少數(shù)射線的高濃度區(qū)域呈現(xiàn)出不同的作用類型外，基本一致。

綜上所述，在不同混合物體系的不同射線中，CA與IA預測線之間的位置關(guān)系始終保持一致，即在總效應為10%以下時，CA與IA預測曲線幾乎重合，但隨著總濃度增加，CA與IA預測曲線的差距逐漸增大；當總濃度較高時，IA預測曲線始終位于CA預測曲線上方，這可能由于抗生素與重金屬具有不同的MOA，而IA模型更適用于相異MOA污染物的混合物毒性評估，從而與實驗觀測值更加接近。這與宋曉青等[17]在部分除草劑與重金屬混合體系對發(fā)光菌的毒性研究中的結(jié)論相似。也有學者認為當混合物組分的CRC較陡(steep concentration response curves)，CA預測混合物毒性高于IA；當混合物組分的CRC較平(flat concentration response curves)，CA預測混合物毒性低于IA，而本研究中2種物質(zhì)的CRC曲線較平緩，但平緩和較陡CRC的界定不明確，尚需進一步深入研究。

本研究得出：

(1) 3種抗生素和重金屬鋅對蛋白核小球藻的毒性隨暴露時間的延長而增強，有明顯的時間依賴性，在暴露時間72 h后，4種物質(zhì)的毒性大小順序為STS>DIH>APR>Zn。

(2) 3組抗生素和重金屬鋅的二元混合物體系，對蛋白核小球藻的毒性相互作用，在低濃度區(qū)域始終呈現(xiàn)加和作用，而在高濃度區(qū)域則隨暴露時間延長從協(xié)同作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧雍妥饔?，具有明顯的時間依賴毒性和濃度依賴毒性。

(3) CA與IA模型對3種抗生素和重金屬Zn的混合物毒性作用評估結(jié)果，除少數(shù)射線的高濃度區(qū)域的作用類型不同外，基本一致，但隨著總濃度增加，CA與IA模型之間預測值的差別逐漸增大，IA預測CRC曲線始終位于CA預測CRC曲線上方，更接近實驗觀測曲線，顯示IA模型更適用于相異MOA污染物的混合物毒性評估。