倪君秀，徐婷，溫家樂，徐小琴，于海瀛，尉小旋，馬廣才

浙江師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，金華 321004

在全世界范圍內(nèi)，吸煙是引發(fā)人體肺癌和口腔癌的主要原因，而煙草制品和煙草煙霧中的特異性亞硝胺(tobacco-specific nitrosamines, TSNAs)類致癌化合物是誘發(fā)這2種癌癥的主要因素之一[1-3]。TSNAs主要包括4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, NNK)、N’-亞硝基降煙堿(N’-nitrosonornicotine, NNN)、N’-亞硝基假木賊堿(N’-nitrosoanabasine, NAB)和N’-亞硝基新煙草堿(N’-nitrosoanatabine, NAT)等4種化合物，如圖1所示，其中NNK和NNN因其高致癌活性而備受關(guān)注，被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)列為第一類致癌物，而NAB和NAT的致癌活性相對較小，為第三類可能致癌物[3-4]。實驗檢測發(fā)現(xiàn)在不同煙草制品中TSNAs的總量可達(dá)313～76 500 ng·g-1[5]，而即使在香煙煙霧中TSNAs的含量亦可達(dá)76.2～571.6 ng·cigarette-1[6]。此外，TSNAs還存于大氣顆粒物中，其平均濃度約為1 ng·m-3[7]。因此煙草暴露會使人體攝入TSNAs，對健康威脅很大。

TSNAs被細(xì)胞色素P450酶代謝活化是其致癌的重要前提[1]。實驗研究發(fā)現(xiàn)很多P450 2A亞家族酶，比如人體P450 2A6和2A13[8-10]、大鼠P450 2A3[11]，都能有效催化NNK和NNN代謝活化。一般而言，TSNAs的致癌性源于P450酶催化的α-羥基化路徑，主要發(fā)生在N-亞硝基基團(tuán)鄰位的2個α-碳位點上。P450先催化TSNAs轉(zhuǎn)化成羥基化中間體，然后再經(jīng)過分子內(nèi)的分解反應(yīng)形成高親電活性的重氮氫氧化物及其他可能的代謝物。比如，NNN代謝可形成4-(3-吡啶基)-4-氧代-丁烷-重氮氫氧化物和4-(3-吡啶基)-4-重氮氫氧基-丁醛2種代謝產(chǎn)物[10,12]。重氮氫氧化物很不穩(wěn)定，能與DNA反應(yīng)形成多種加合物，導(dǎo)致DNA受損，進(jìn)而誘發(fā)癌癥。近年來，P450酶代謝活化NNK和NNN的反應(yīng)機理以及代謝物的遺傳毒性已經(jīng)被廣泛研究并且取得了重要進(jìn)展，但NAB和NAT在P450酶中的代謝活化研究卻鮮有報道，潛在代謝物與DNA作用的加合物也沒有被檢測。Liu等[13-14]發(fā)現(xiàn)NAT和NAB均可競爭性抑制P450 2A13酶催化的NNK和NNN代謝，但是抑制機理并不明確。早期的實驗研究發(fā)現(xiàn)吸煙者尿液中解毒的吡啶氮氧化物占了NAB總劑量的25%～30%，而α-羥基化產(chǎn)物的占比小于10%；相比之下，尿液中NNN的吡啶氮氧化物占比6%～11%，而α-羥基化產(chǎn)物占37%[1]。該結(jié)果有效解釋了NAB致癌活性低于NNN的原因，且暗示了NAB在P450酶中的可能代謝路徑。NAB和NAT的雙環(huán)和手性結(jié)構(gòu)特征與NNN很相似，它們在P450酶中的代謝路徑是否也與NNN類似？反應(yīng)的動力學(xué)和毒理學(xué)相關(guān)性以及反應(yīng)的機理細(xì)節(jié)如何？哪一條羥基化路徑主導(dǎo)了它們的代謝命運？這些問題仍有待探討。雖然NAB和NAT是弱致癌物，但是研究它們在P450酶中的活化機制對于我們系統(tǒng)認(rèn)知TSNAs的代謝路徑及致癌機理都有一定的幫助。

圖1 4種煙草特異性亞硝胺(TSNAs)的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Chemical structures of four tobacco-specific nitrosamines (TSNAs)

近年來，量子化學(xué)計算已經(jīng)被廣泛且成功地應(yīng)用于研究P450酶與各種外源性有機化合物之間的相互作用[15-19]，為我們的研究提供了良好的理論基礎(chǔ)。在本文中，我們使用密度泛函理論(DFT)計算系統(tǒng)研究并比較了P450酶催化的NAT和NAB α-羥基化路徑，明確了反應(yīng)的機理細(xì)節(jié)及能量關(guān)系。該研究結(jié)果有助于系統(tǒng)理解NAT和NAB的代謝過程以綜合評價不同TSNAs的致癌潛力，并有助于識別潛在的生物標(biāo)志物用于合理評估這2種煙草特異性亞硝胺暴露的健康風(fēng)險。

1 計算細(xì)節(jié)(Computational details)

1.1 計算模型

1.2 密度泛函理論(DFT)計算

本文中所有的DFT計算都由Gaussian 09軟件包完成[25]。分子構(gòu)型優(yōu)化使用雜化B3LYP泛函[26-27]，其中Fe原子使用LANL2DZ贗勢基組[28]，而其他原子用6-31G(d,p)基組計算[29]。選擇B3LYP泛函是因為即使與最精確的基準(zhǔn)CCSDT(Q)方法相對比，它也能很準(zhǔn)確地預(yù)測Fe-卟啉復(fù)合物的不同自旋態(tài)能量以及反應(yīng)路徑的相對能量關(guān)系[30-31]。通過頻率計算獲取優(yōu)化構(gòu)型的Gibbs自由能校正值，并驗證優(yōu)化構(gòu)型的合理性，其中過渡態(tài)鞍點有且只有一個虛頻，而局域最小點無虛頻。為了獲取更精確的能量數(shù)據(jù)，在優(yōu)化構(gòu)型的基礎(chǔ)上使用更高水平的Wacthers+f (Fe原子)和6-311++G(d,p) (其他原子)基組進(jìn)行單點能計算[32-34]。使用SMD溶劑化模型及非極性的氯苯溶劑(介電常數(shù)為5.62)對真實的P450酶環(huán)境進(jìn)行隱性模擬[35]。此外，在單點能計算時引入半經(jīng)驗的色散校正以彌補B3LYP泛函不能準(zhǔn)確描述長程色散效應(yīng)的缺陷[36]。因此，本文報道的最終能量數(shù)據(jù)為相對自由能，其綜合考慮了單點能、溶劑化效應(yīng)、色散效應(yīng)及Gibbs自由能校正。

圖2 密度泛函理論(DFT)計算中使用的Cpd I模型及底物NAB和NATFig. 2 Simple Cpd I model and substrates NAB and NAT used in the present density functional theory (DFT) calculations

2 結(jié)果(Results)

2.1 Cpd I催化的N’-亞硝基新煙草堿(NAT)致癌活化

NAT 2-羥基化路徑的LS態(tài)相對自由能剖面見圖3。TS2-H為優(yōu)化的氫原子奪取反應(yīng)的過渡態(tài)，其中Fe···O距離為1.72 ?，O···H距離為1.23 ?，而C2···H距離為1.33 ?。在優(yōu)化的中間體IM2-H中，F(xiàn)e···OH距離進(jìn)一步拉伸到1.85 ?。計算表明，氫奪取能壘為21.6 kcal·mol-1，而IM2-H的形成會放出4.3 kcal·mol-1的能量，有利于隨后的羥基自由基轉(zhuǎn)移。實際上，從FeIV—OH到Cα自由基的羥基轉(zhuǎn)移是一個無能壘的過程，而且IM2-OH中間體的形成伴隨著劇烈的放熱(-40.2 kcal·mol-1)。盡管IM2-OH表現(xiàn)出相對高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，但是其獨特的結(jié)構(gòu)特征能誘導(dǎo)其自發(fā)的分子內(nèi)分解反應(yīng)，即—OH轉(zhuǎn)移一個質(zhì)子給—NO基團(tuán)，同時C2—N1鍵斷裂，形成產(chǎn)物P2-DiazoOH。TS2-DiazoOH為自發(fā)分解反應(yīng)的過渡態(tài)，其中C2···N1距離伸長到1.82 ?，同時O···H伸長到1.44 ?，而Fe···O距離從IM2-OH中的2.73 ?進(jìn)一步縮短到2.28 ?，表明FeIII-卟啉的存在有助于該反應(yīng)的發(fā)生。相對于IM2-OH，分解反應(yīng)的能壘為14.1 kcal·mol-1，小于初始的氫奪取能壘(21.6 kcal·mol-1)；而P2-DiazoOH形成則需要吸收2.4 kcal·mol-1的熱量。此外，在整個2-羥基化路徑中，氫奪取反應(yīng)的能壘最高，是該路徑的決速步驟，且IM2-OH和P2-DiazoOH都是該路徑潛在的酶催化代謝物。

圖3 NAT 2-羥基化路徑的二重自旋態(tài)能量剖面圖及優(yōu)化的分子構(gòu)型注：圖中能量數(shù)據(jù)相對于反應(yīng)復(fù)合物(Cpd I + NAT)給出，能量單位為kcal·mol-1，距離單位為?。TS2-H為氫原子奪取過渡態(tài)，IM2-H為C2-自由基中間體，IM2-OH為2-羥基化NAT中間體，TS2-DiazoOH為分解反應(yīng)過渡態(tài)，P2-DiazoOH為產(chǎn)物復(fù)合物。Fig. 3 Free energy profile for NAT 2-hydroxylaiton pathway catalyzed by Cpd I of P450, along with the optimized geometries of key reaction species in the doublet-spin stateNote: Free energies (kcal·mol-1) are relative to the reactant complex (Cpd I + NAT), and the distances are given in ?. TS2-H is transition state of hydrogen atom abstraction; IM2-H is C2-radical intermediate; IM2-OH is 2-hydroxyNAT intermediate; TS2-DiazoOH is transition state of decomposition; P2-DiazoOH is product complex.

2.2 Cpd I催化的N’-亞硝基假木賊堿(NAB)致癌活化

圖4 NAT 6-羥基化路徑的二重自旋態(tài)能量剖面圖及優(yōu)化的分子構(gòu)型注：能量數(shù)據(jù)相對于反應(yīng)復(fù)合物(Cpd I + NAT)給出，能量單位為kcal·mol-1，距離單位為?。TS6-H為氫原子奪取過渡態(tài)，IM6-H為C6-自由基中間體，IM6-OH為6-羥基化NAT中間體，TS6-DiazoOH為分解反應(yīng)過渡態(tài)，P6-DiazoOH為產(chǎn)物復(fù)合物。Fig. 4 Free energy profile for NAT 6-hydroxylaiton pathway catalyzed by Cpd I of P450, along with the optimized geometries of key reaction species in the doublet-spin stateNote: Free energies (kcal·mol-1) are relative to the reactant complex (Cpd I + NAT), and the distances are given in ?. TS6-H is transition state of hydrogen atom abstraction; IM6-H is C6-radical intermediate; IM6-OH is 6-hydroxyNAT intermediate; TS6-DiazoOH is transition state of decomposition; P6-DiazoOH is product complex.

NAB 2’-羥基化路徑的相對自由能剖面見圖5，其中氫奪取反應(yīng)的過渡態(tài)標(biāo)記為TS’2-H以區(qū)別于NAT的TS2-H，相應(yīng)形成的自由基中間體標(biāo)記為IM’2-H。計算的氫奪取能壘為12.7 kcal·mol-1，放出的熱量為13.7 kcal·mol-1。隨后的OH轉(zhuǎn)移形成穩(wěn)定2’-羥基化NAB中間體IM’2-OH同樣是劇烈放熱的過程，放出約48 kcal·mol-1的熱量。2’-羥基化NAB進(jìn)一步經(jīng)過分子內(nèi)分解過渡態(tài)TS’2-DiazoOH(能壘為15.8 kcal·mol-1)形成略微吸熱的重氮羥基化代謝產(chǎn)物P’2-DiazoOH。

對于NAB 6’-羥基化路徑(見圖6)，氫奪取能壘為12.9 kcal·mol-1，與2’-羥基化路徑的氫奪取能壘(12.7 kcal·mol-1)幾乎相等；而6’-羥基化NAB中間體(IM’6-OH)的自發(fā)分解能壘為20.1 kcal·mol-1，明顯高于2’-羥基化NAB的分解能壘(15.8 kcal·mol-1)。該結(jié)果表明，Cpd I催化的2’-羥基化路徑在動力學(xué)上比6’-羥基化路徑更容易發(fā)生，即P450酶催化的2’-羥基化路徑有可能主導(dǎo)了NAB的致癌潛力。事實上，α-羥基化NAB中間體和重氮氫氧化產(chǎn)物的相對能壘相差不大，具有相似的熱力學(xué)穩(wěn)定性，因此它們都是NAB α-羥基化路徑的潛在代謝產(chǎn)物。

3 討論(Discussion)

煙草特異性亞硝胺NAT和NAB的致癌活性小于NNK和NNN，因此其在P450酶中的代謝活化并未被深入研究。到目前為止，僅有一個早期的實驗報道了NAB 2’-羥基化和6’-羥基化反應(yīng)的可能性，但相關(guān)代謝物與DNA作用的加合物也未被檢測[37]，這在一定程度上不利于我們真實客觀地理解這2種污染物的代謝機制及致癌活性。因此，本文基于量子化學(xué)計算系統(tǒng)研究了P450酶催化NAT和NAB代謝活化的分子機制(圖7)，定量了致癌的α-羥基化活化路徑的能壘和熱力學(xué)信息。計算表明，NAT和NAB的α-羥基化路徑相似，均包括以下基元反應(yīng)步驟：(1) 氫原子奪取，形成Cα自由基中間體；(2) 無能壘的OH轉(zhuǎn)移，形成劇烈放熱的α-羥基化中間體；(3) 自發(fā)的α-羥基化中間體分子內(nèi)分解，形成最終有致癌潛力的重氮氫氧化物。進(jìn)一步比較NAT 2-羥基化和6-羥基化路徑發(fā)現(xiàn)，雖然前者的氫奪取能壘高于后者(21.6 vs 17.9 kcal·mol-1)，但前者的羥基化中間體的自發(fā)分解能壘更低(14.1 vs 18.6 kcal·mol-1)，表明P450酶催化的NAT 2-羥基化和6-羥基化反應(yīng)都是潛在的致癌路徑，且在動力學(xué)上可能相互競爭。

圖5 NAB 2’-羥基化路徑的二重自旋態(tài)能量剖面圖及優(yōu)化的分子構(gòu)型注：其中能量數(shù)據(jù)相對于反應(yīng)復(fù)合物(Cpd I + NAB)給出，能量單位為kcal·mol-1，距離單位為?。TS’2-H為氫原子奪取過渡態(tài)，IM’2-H為C’2-自由基中間體，IM’2-OH為2’-羥基化NAB中間體，TS’2-DiazoOH為分解反應(yīng)過渡態(tài)，P’2-DiazoOH為產(chǎn)物復(fù)合物。Fig. 5 Free energy profile for NAB 2’-hydroxylaiton pathway catalyzed by Cpd I of P450, along with the optimized geometries of key reaction species in the doublet-spin stateNote: Free energies (kcal·mol-1) are relative to the reactant complex (Cpd I + NAB), and the distances are given in ?. TS’2-H is transition state of hydrogen atom abstraction; IM’2-H is C’2-radical intermediate; IM’2-OH is 2’-hydroxyNAB intermediate; TS’2-DiazoOH is transition state of decomposition, and P’2-DiazoOH is product complex.

圖6 NAB 6’-羥基化路徑的二重自旋態(tài)能量剖面圖及優(yōu)化的分子構(gòu)型注：其中能量數(shù)據(jù)相對于反應(yīng)復(fù)合物(Cpd I + NAB)給出，能量單位為kcal·mol-1，距離單位為?。TS’6-H為氫原子奪取過渡態(tài)，IM’6-H為C’6-自由基中間體，IM’6-OH為6’-羥基化NAB中間體，TS’6-DiazoOH為分解反應(yīng)過渡態(tài)，P’6-DiazoOH為產(chǎn)物復(fù)合物。Fig. 6 Free energy profile for NAB 6’-hydroxylaiton pathway catalyzed by Cpd I of P450, along with the optimized geometries of key reaction species in the doublet-spin stateNote: Free energies (kcal·mol-1) are relative to the reactant complex (Cpd I + NAB), and the distances are given in ?. TS’6-H is transition state of hydrogen atom abstraction, IM’6-H is C’6-radical intermediate, IM’6-OH is 6’-hydroxyNAB intermediate, TS’6-DiazoOH is transition state of decomposition, and P’6-DiazoOH is product complex.

NAB α-羥基化路徑中氫奪取能壘為12.7～12.9 kcal·mol-1，α-羥基化中間體分解能壘為15.8～20.1 kcal·mol-1。此外，盡管2’-羥基化和6’-羥基化路徑的氫奪取能壘幾乎相等，但前者的羥基化中間體分解能壘更低，表明2’-羥基化路徑是NAB的主要致癌路徑。進(jìn)一步比較NAT和NAB的活化路徑發(fā)現(xiàn)，NAT的氫奪取能壘遠(yuǎn)高于NAB，而前者的分解能壘只是略小于后者，因此NAB在P450酶中的代謝活性應(yīng)該更高，即NAB的致癌活性可能略高于NAT。此外，計算表明α-羥基化NAT和NAB中間體與相應(yīng)的重氮氫氧化代謝產(chǎn)物具有相似的熱力學(xué)穩(wěn)定性，且自發(fā)分解反應(yīng)的相對能壘也較高(大于14 kcal·mol-1)，因此α-羥基化中間體和重氮氫氧化物都是潛在的P450酶催化代謝產(chǎn)物。事實上，重氮氫氧化物不僅可能與DNA反應(yīng)形成多種DNA加合物，也可能會進(jìn)一步水解成低毒性甚至無毒性的醇類化合物。因此，相關(guān)的DNA加合物、醇類水解物以及α-羥基化中間體都可以作為潛在的生物標(biāo)志物用以評估NAT和NAB在P450酶中的活化潛力及人體暴露的健康風(fēng)險。

圖7 P450酶催化的NAT和NAB α-羥基化致癌路徑Fig. 7 P450-catalyzed genotoxic α-hydroxylation routes for NAT and NAB

另外2種具有更強致癌活性的煙草特異性亞硝胺NNK和NNN以及其他常見亞硝胺如N-亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine, NPYR)和N-亞硝基哌啶(N-nitrosopiperidine, NPIP)等具有與NAT和NAB相似的活性亞硝胺基團(tuán)，因此理論上它們具有相似的致癌活化路徑。我們基于DFT計算已經(jīng)系統(tǒng)研究了P450酶催化NNN代謝活化的分子機制[15]，再結(jié)合本文的研究結(jié)果，我們進(jìn)一步證實P450酶催化的2種α-羥基化路徑是亞硝胺類化合物發(fā)揮其致癌活性的重要前提。此外，本文的研究結(jié)果也可為其他亞硝胺類致癌物的酶催化代謝活化研究提供一定的理論指導(dǎo)。