馬 群,張夢陽,李宜波,劉忠杰,向 征
(湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司,湖北松滋 434200)
大曲是大曲酒的糖化發(fā)酵劑,它是以大麥、小麥、豌豆等為主要原料,經(jīng)粉碎、加水拌料、壓制成型后,在一定的溫度、濕度條件下培育而成。大曲中主要含有霉菌、酵母菌和細菌等微生物,是一種多菌種混合發(fā)酵曲。大曲在釀造的過程中既是糖化發(fā)酵劑,又是釀酒原料,對形成酒的風格和提高酒質(zhì)起著決定性的作用。目前大曲的質(zhì)量檢驗除了常規(guī)的感官檢驗外,還包括部分理化指標的檢測。
在理化指標的檢測中,大曲的液化力體現(xiàn)了大曲中的微生物及酶降解淀粉的能力,是一項重要的檢測指標。液化型淀粉酶(又稱α-淀粉酶),能將淀粉分子鏈中的α-1,4葡萄糖苷鍵隨機切斷成長短不一的短鏈糊精、少量的麥芽糖和葡萄糖,而使淀粉對碘呈藍紫色的特性反應逐漸消失,呈現(xiàn)棕紅色,其顏色消失的速度與酶活性有關(guān),據(jù)此可以測定液化酶活力。在各釀酒企業(yè)中,均對大曲的此項指標進行了檢測,而且檢測方法基本采用傳統(tǒng)的比色法。隨著科學技術(shù)的進步和借助先進的儀器設(shè)備,應用分光光度計測定液化酶活力的方法也應運而生。本文著重對比分析了這兩種方法在大曲液化酶活力檢測中的應用,為后續(xù)大曲液化酶活力檢測方法的選用提供一定的參考。
材料:滴定管、恒溫水浴鍋、自動移液器、25mL試管、250mL燒杯、100mL容量瓶、150mL三角瓶。
儀器:分光光度計。
淀粉溶液(20 g/L):稱取10.00 g 預先于100~105 ℃烘干2 h 的可溶性淀粉,用水調(diào)成糊狀,不斷攪拌下注入400 mL 沸水,繼續(xù)煮沸至透明。冷卻后,在500 mL 容量瓶中定容至刻度,搖勻。此溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,若用量較少,可按比例適當減少配制量。
原碘液:稱取11 g 碘,22 g 碘化鉀,置于研缽中,加入少量水,研磨至碘完全溶解,用水稀釋至500 mL,搖勻。貯存于棕色瓶中靜置過夜。
稀碘液:量取2 mL 原碘液,加入20 g 碘化鉀,用水稀釋至500 mL,搖勻。貯存于棕色瓶中靜置過夜。
糊精溶液:稱取0.3 g 糊精溶于50 mL 水中,加熱溶解。
磷酸緩沖溶液(pH6.0):稱取45.23 g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)和8.07 g 檸檬酸(C6H8O7·H2O),用水溶解并定容至100 mL,再用pH 計校正后使用。
鹽酸溶液[c(HCl)=0.1 mol/L]:按GB/T 601配制。
可溶性淀粉溶液(4 g/L):稱取1.000 g(精確至0.001 g)可溶性淀粉(以絕干計)于燒杯中,用少量水調(diào)成漿狀物,邊攪拌邊緩緩加入70 mL 沸水中,然后用水多次沖洗裝淀粉的燒杯,洗液倒入其中,攪拌加熱至完全透明,冷卻定容至250 mL。溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。注:可溶性淀粉采用酶制劑專用可溶性淀粉。
1.2.1 標準顏色的配制
在50 mL 試管中加入5 mL 稀碘液,再滴入1~2滴糊精溶液,搖勻。
1.2.2 固體曲浸出液的制備
稱取5 g 大曲粉(精確至0.0001 g),用少量磷酸緩沖液充分溶解,于40 ℃水浴鍋中浸取2 h,每隔15 min 攪拌1 次(保證酶液完全浸取出來,并將大曲自身的淀粉消耗殆盡),將上清液小心傾入容量瓶中,若有剩余殘渣,再加少量磷酸緩沖液充分研磨,最終樣品全部移入100 mL 容量瓶中,用磷酸緩沖液定容至刻度,搖勻。用4 層紗布過濾,濾液待用。
吸取25 mL 20.0 g/L 可溶性淀粉溶液和5 mL磷酸緩沖溶液于100 mL 試管中于35 ℃水浴中保溫10 min 后,加入固體曲浸出液V mL(因高溫曲和中溫曲液化力差異較大,測試高溫曲時加入20 mL固體曲浸出液,若測試的是中溫曲則加入2 mL 固體曲浸出液),再加入10 mL 水,充分搖勻,開始計時。繼續(xù)于40 ℃保溫,定時取出1滴反應液加入裝有稀碘液的試管內(nèi),觀察顏色變化。當?shù)庖侯伾c標準顏色一致時即反應終點,此刻立即記錄液化時間t(min)。
1.2.3 計算
固體曲液化力的定義:在35 ℃,1 g 大曲1 h 液化可溶性淀粉的質(zhì)量。
式中:X——液化力(可溶性淀粉,g/g·h);
25.0——可溶性淀粉溶液用量(mL);
0.020——可溶性淀粉溶液濃度(g/mL);
V——加入的固體曲浸出液的體積(mL);
60——1 h換算成的分鐘數(shù)(min);
t——液化時間(min)。
α-淀粉酶活力定義:1 g 固體酶粉(或1 mL 液體酶),于60 ℃、pH6.0 的條件下,1 min 液化1 mg可溶性淀粉,即為1 個酶活力單位,以“U/g(U/mL)”表示。
1.3.1 待測酶液的制備
稱取10 g 大曲粉(精確至0.0001 g),后續(xù)待測酶液制備方法同1.2.2。
1.3.2 制作淀粉溶液濃度梯度與吸光度的標準曲線
淀粉標準溶液的制備:稱取1.5 g 淀粉,定容至250 mL容量瓶中。制作淀粉濃度為0 g/L、0.075 g/L、0.15 g/L、0.30 g/L、0.45 g/L、0.60 g/L、0.90 g/L 的標準溶液,用自動移液器吸取1.00 mL淀粉溶液(空白對照樣加入1.00 mL 磷酸緩沖液)加到預先盛有0.5 mL鹽酸溶液和5.00 mL稀碘液的試管中,搖勻,并以0.5 mL 鹽酸溶液和5.00 mL 稀碘液為空白,于660 nm 波長下,測定其吸光度(A)。并制作淀粉濃度與吸光度標準曲線,見圖1。
1.3.3 測定
吸取10.0 mL 濃度為4 g/L 可溶性淀粉溶液、10 mL無菌水、5 mL磷酸緩沖溶液于150 mL三角瓶中,搖勻后,置于60 ℃的恒溫水浴中預熱8 min。加入1.00 mL稀釋好的待測酶液立即計時,搖勻,準確反應10 min。立即用自動移液器吸取1.00 mL 反應液(空白對照樣加入1.00 mL 磷酸緩沖液),加到預先盛有0.5 mL 鹽酸溶液和5.00 mL 稀碘液的試管中,搖勻,并以0.5 mL 鹽酸溶液和5.00 mL 稀碘液為空白,于660 nm波長下,測定其吸光度(A)。
根據(jù)標準曲線的公式y(tǒng)=0.8475x-0.0145,假設(shè)y0為空白對照樣淀粉濃度,y 為待測樣淀粉濃度。代入公式計算反應過程中淀粉的消耗量,y0-y=0.8475(x0-x),根據(jù)α-淀粉酶活力定義計算α-淀粉酶活力X:
式中:X——樣品的酶活力,U/mL;
c——測試酶樣濃度,g/mL;
v——反應中加入待測酶液量,mL;
t——反應時間,(min)。
式中c=0.1 g/mL;v=1.00 mL;t=10 min。
為了比較兩種檢測方法的優(yōu)劣,我們隨機選取原料車間粉碎好的兩個高溫曲樣作為試驗樣品,分別從反應所需時間和檢測結(jié)果的準確度和精密度方面進行比較。
2.1.1 傳統(tǒng)檢測方法的反應時間
由1.2.2 可知,前期準備工作除外,固體曲浸出液的制備需要120 min,液化所需時間跟成品曲液化力大小相關(guān)。根據(jù)1.2.3 固體曲液化力的計算公式,由于試驗的是高溫曲,式中v=2 mL,代入公式計算。而白云邊公司高溫曲液化力的檢驗合格標準是0.2~0.6 g/g·h。而當液化力為0.2 g/g·h 時,反應時間t 為150 min;當液化力為0.6 g/g·h 時,反應時間為50 min。假設(shè)前期準備工作和中途液化反應液的制備共需要30 min,那么合格曲的液化力檢測時間在200~300 min 之間,成品曲入庫之前,會有部分液化力偏低的不合格曲,這些不合格曲的檢測時間更長。
2.1.2 分光光度計法的反應時間
分光光度計法測定酶活中前期藥品配制等準備工作除外,假設(shè)大曲粉浸提前的準備工作需要15 min,淀粉溶液的配制等準備工作可以在酶液提取的過程中進行,酶液提取時間2 h,預熱反應8 min,酶解10 min,最后測定吸光度,檢測時間5 min。分光光度法測定酶活,耗時158 min。因為反應底物濃度的變化由吸光度大小決定。所以無論成品曲液化力多少,反應時間都是固定的。
將試驗曲分別設(shè)為樣品1 和樣品2。為了比較兩種檢測結(jié)果的準確度和精密度,分別用傳統(tǒng)法和分光光度法兩種試驗方法檢測,即稱為方法一和方法二。每種方法測定了7 組數(shù)據(jù)。測定結(jié)果見表1和表2。
2.2.1 準確度的比較
準確度是指測量值與真實值之間相符合的程度。準確度的高低常以誤差的大小來衡量。即誤差越小,準確度越高;誤差越大,準確度越低。由于樣本的真實值是不可知的,在日常分析工作中,需對試樣作平行測定,取其算術(shù)平均值作為真實值。從表1 可知,用方法一測得樣品1 液化力的平均值為0.432 g/g·h,可以作為方法一測得的真實值用于計算該組數(shù)據(jù)的相對誤差。用方法二測得樣品1酶活力的平均值為0.584 U/mL,可以作為方法二測得的真實值用于計算該組數(shù)據(jù)的相對誤差。同理,表2 中樣品2 液化力的平均值為0.251 g/g·h,酶活力的平均值為0.385 U/mL。均可作為這兩組數(shù)據(jù)的真實值計算相對誤差。相對誤差是指誤差在真實值中所占的百分率。相對誤差的表示方法是:
表1 樣品1兩種試驗方法檢測結(jié)果對照表
表2 樣品2兩種試驗方法檢測結(jié)果對照表
樣品1 和樣品2 兩種方法測定相對誤差結(jié)果對比柱形圖見圖2、圖3。由圖2 和圖3 可以看出,無論是樣品1 還是樣品2,用傳統(tǒng)檢測法測定的相對誤差值明顯要比分光光度法大。也就是說分光光度法測定成品曲酶活力的準確度要顯著高于傳統(tǒng)測液化力方法。(注:柱形圖的比較更具直觀性,數(shù)據(jù)處理時按大小順序排列,并非測量先后順序。)
2.2.2 精密度的比較
精密度是指在相同條件下n 次重復測定結(jié)果彼此相符合的程度。精密度的大小用偏差表示,偏差愈小,說明精密度愈高。絕對偏差表示單個樣本的精密度,用測定值減平均值來表示。
圖2 樣品1兩種方法測定結(jié)果相對誤差對比圖
圖3 樣品2兩種方法測定結(jié)果相對誤差對比圖
在數(shù)理統(tǒng)計中,一般測定次數(shù)有限,常用樣本標準偏差來表示精密度,其數(shù)學表達式(貝塞爾公式)為:
式中xi為單個樣本值為樣本平均值。(n-1)在統(tǒng)計學中稱為自由度,意思是在n 次測量中,只有(n-1)個獨立可變的偏差,因為n 個絕對偏差之和等于零,所以只要知道(n-1)個絕對偏差,就可以確定第n個的偏差值。
通過表3 和表4 的絕對偏差值(xi)代入貝賽爾公式計算。
樣品1樣本標準偏差(S)分別為:
表3 樣品1測定值絕對偏差對照表
表4 樣品2測定值絕對偏差對照表
樣品2的樣本標準偏差(S)分別為:
比較兩個樣品分別用傳統(tǒng)方法和分光光度法檢測數(shù)據(jù)的樣本標準偏差S1和S2可以說明使用分光光度法檢測所得數(shù)據(jù)的精密度高。因為該組數(shù)據(jù)較集中并接近標準數(shù)據(jù)。由此可見,欲使準確度高,首先必須要求精密度也高,但精密度高并不說明準確度也高,因為可能在測定中存在系統(tǒng)誤差,但精密度是保證準確度的先決條件。
分光光度法檢測大曲粉酶活力反應時間需要158 min。傳統(tǒng)液化力檢測法反應時間和測試所用成品曲的液化力相關(guān),合格曲的液化力檢測時間在200~300 min 之間,液化力偏低的不合格曲的檢測時間更長。兩種檢測方法反應原理相同,都是通過在一定溫度下發(fā)生酶解反應,使碘遇淀粉呈現(xiàn)的藍紫色反應逐漸消失,其顏色消失的速度與測定的液化酶活力是相關(guān)的。傳統(tǒng)檢測法需要等待淀粉酶將淀粉徹底酶解至藍紫色消失,這與測試樣的液化力相關(guān),所以耗時長。而分光光度法則是讓待測試樣統(tǒng)一反應10 min后,利用分光光度計檢測試樣顏色深淺的變化,即利用試樣顏色消失的速度來衡量酶活力的高低,通過反應后的吸光度計算酶活力。這樣會大大縮短檢測時間。
通過圖1 和圖2 可知,傳統(tǒng)檢測法的相對誤差要明顯高于分光光度法。而準確度的高低用相對誤差來衡量。所以分光光度法檢測結(jié)果的準確度高于傳統(tǒng)檢測法。通過比較利用兩種方法檢測的樣品1 和樣品2 的樣本標準偏差S1和S2可以說明,使用分光光度法檢測所得數(shù)據(jù)的精密度高。因為傳統(tǒng)檢測法是定時取出一滴反應液于加入裝有稀碘液的試管內(nèi),觀察顏色變化,我們試驗中是待顏色變淺時每隔2 min 測試一遍,測試也需要間隔時間,所以間隔時間不能再縮短,而遇到液化力大的試樣,顏色變化極快,仍然會帶來時間上的延遲誤差。且肉眼觀察,也會帶來終點顏色的判斷誤差。而分光光度法可以避免上述誤差的出現(xiàn)。
俗話說:“曲乃酒之骨。”大曲對白酒產(chǎn)量和質(zhì)量起著決定性作用。其淀粉酶活力直接影響酒醅中淀粉的轉(zhuǎn)化率及出酒率。準確測定大曲淀粉酶活力,生產(chǎn)中合理配比成曲用量至關(guān)重要。分光光度法測定酶活力相比傳統(tǒng)液化力檢測法既快速又準確?,F(xiàn)代科技進步日新月異,先進的檢測方法必將逐漸取代傳統(tǒng)檢測法。