馬 群，張夢(mèng)陽，李宜波，劉忠杰，向 征

（湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北松滋 434200）

大曲是大曲酒的糖化發(fā)酵劑，它是以大麥、小麥、豌豆等為主要原料，經(jīng)粉碎、加水拌料、壓制成型后，在一定的溫度、濕度條件下培育而成。大曲中主要含有霉菌、酵母菌和細(xì)菌等微生物，是一種多菌種混合發(fā)酵曲。大曲在釀造的過程中既是糖化發(fā)酵劑，又是釀酒原料，對(duì)形成酒的風(fēng)格和提高酒質(zhì)起著決定性的作用。目前大曲的質(zhì)量檢驗(yàn)除了常規(guī)的感官檢驗(yàn)外，還包括部分理化指標(biāo)的檢測(cè)。

在理化指標(biāo)的檢測(cè)中，大曲的液化力體現(xiàn)了大曲中的微生物及酶降解淀粉的能力，是一項(xiàng)重要的檢測(cè)指標(biāo)。液化型淀粉酶（又稱α-淀粉酶），能將淀粉分子鏈中的α-1,4葡萄糖苷鍵隨機(jī)切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精、少量的麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對(duì)碘呈藍(lán)紫色的特性反應(yīng)逐漸消失，呈現(xiàn)棕紅色，其顏色消失的速度與酶活性有關(guān)，據(jù)此可以測(cè)定液化酶活力。在各釀酒企業(yè)中，均對(duì)大曲的此項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，而且檢測(cè)方法基本采用傳統(tǒng)的比色法。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和借助先進(jìn)的儀器設(shè)備，應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定液化酶活力的方法也應(yīng)運(yùn)而生。本文著重對(duì)比分析了這兩種方法在大曲液化酶活力檢測(cè)中的應(yīng)用，為后續(xù)大曲液化酶活力檢測(cè)方法的選用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：滴定管、恒溫水浴鍋、自動(dòng)移液器、25mL試管、250mL燒杯、100mL容量瓶、150mL三角瓶。

儀器：分光光度計(jì)。

淀粉溶液（20 g/L）：稱取10.00 g 預(yù)先于100～105 ℃烘干2 h 的可溶性淀粉，用水調(diào)成糊狀，不斷攪拌下注入400 mL 沸水，繼續(xù)煮沸至透明。冷卻后，在500 mL 容量瓶中定容至刻度，搖勻。此溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，若用量較少，可按比例適當(dāng)減少配制量。

原碘液：稱取11 g 碘，22 g 碘化鉀，置于研缽中，加入少量水，研磨至碘完全溶解，用水稀釋至500 mL，搖勻。貯存于棕色瓶中靜置過夜。

稀碘液：量取2 mL 原碘液，加入20 g 碘化鉀，用水稀釋至500 mL，搖勻。貯存于棕色瓶中靜置過夜。

糊精溶液：稱取0.3 g 糊精溶于50 mL 水中,加熱溶解。

磷酸緩沖溶液（pH6.0）：稱取45.23 g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)和8.07 g 檸檬酸(C6H8O7·H2O)，用水溶解并定容至100 mL，再用pH 計(jì)校正后使用。

鹽酸溶液[c(HCl)=0.1 mol/L]：按GB/T 601配制。

可溶性淀粉溶液(4 g/L)：稱取1.000 g(精確至0.001 g)可溶性淀粉(以絕干計(jì))于燒杯中,用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入70 mL 沸水中，然后用水多次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻定容至250 mL。溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。注：可溶性淀粉采用酶制劑專用可溶性淀粉。

1.2 傳統(tǒng)比色方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)顏色的配制

在50 mL 試管中加入5 mL 稀碘液，再滴入1～2滴糊精溶液，搖勻。

1.2.2 固體曲浸出液的制備

稱取5 g 大曲粉(精確至0.0001 g)，用少量磷酸緩沖液充分溶解，于40 ℃水浴鍋中浸取2 h，每隔15 min 攪拌1 次（保證酶液完全浸取出來，并將大曲自身的淀粉消耗殆盡）,將上清液小心傾入容量瓶中,若有剩余殘?jiān)?再加少量磷酸緩沖液充分研磨,最終樣品全部移入100 mL 容量瓶中,用磷酸緩沖液定容至刻度,搖勻。用4 層紗布過濾,濾液待用。

吸取25 mL 20.0 g/L 可溶性淀粉溶液和5 mL磷酸緩沖溶液于100 mL 試管中于35 ℃水浴中保溫10 min 后，加入固體曲浸出液V mL(因高溫曲和中溫曲液化力差異較大，測(cè)試高溫曲時(shí)加入20 mL固體曲浸出液,若測(cè)試的是中溫曲則加入2 mL 固體曲浸出液)，再加入10 mL 水，充分搖勻，開始計(jì)時(shí)。繼續(xù)于40 ℃保溫，定時(shí)取出1滴反應(yīng)液加入裝有稀碘液的試管內(nèi)，觀察顏色變化。當(dāng)?shù)庖侯伾c標(biāo)準(zhǔn)顏色一致時(shí)即反應(yīng)終點(diǎn)，此刻立即記錄液化時(shí)間t(min)。

1.2.3 計(jì)算

固體曲液化力的定義：在35 ℃，1 g 大曲1 h 液化可溶性淀粉的質(zhì)量。

式中：X——液化力(可溶性淀粉，g/g·h)；

25.0——可溶性淀粉溶液用量(mL)；

0.020——可溶性淀粉溶液濃度(g/mL)；

V——加入的固體曲浸出液的體積（mL）；

60——1 h換算成的分鐘數(shù)（min）；

t——液化時(shí)間(min)。

1.3 分光光度法

α-淀粉酶活力定義：1 g 固體酶粉（或1 mL 液體酶），于60 ℃、pH6.0 的條件下，1 min 液化1 mg可溶性淀粉，即為1 個(gè)酶活力單位，以“U/g(U/mL)”表示。

1.3.1 待測(cè)酶液的制備

稱取10 g 大曲粉(精確至0.0001 g)，后續(xù)待測(cè)酶液制備方法同1.2.2。

1.3.2 制作淀粉溶液濃度梯度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：稱取1.5 g 淀粉，定容至250 mL容量瓶中。制作淀粉濃度為0 g/L、0.075 g/L、0.15 g/L、0.30 g/L、0.45 g/L、0.60 g/L、0.90 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用自動(dòng)移液器吸取1.00 mL淀粉溶液（空白對(duì)照樣加入1.00 mL 磷酸緩沖液）加到預(yù)先盛有0.5 mL鹽酸溶液和5.00 mL稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5 mL 鹽酸溶液和5.00 mL 稀碘液為空白，于660 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光度(A)。并制作淀粉濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

1.3.3 測(cè)定

吸取10.0 mL 濃度為4 g/L 可溶性淀粉溶液、10 mL無菌水、5 mL磷酸緩沖溶液于150 mL三角瓶中，搖勻后，置于60 ℃的恒溫水浴中預(yù)熱8 min。加入1.00 mL稀釋好的待測(cè)酶液立即計(jì)時(shí)，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min。立即用自動(dòng)移液器吸取1.00 mL 反應(yīng)液（空白對(duì)照樣加入1.00 mL 磷酸緩沖液），加到預(yù)先盛有0.5 mL 鹽酸溶液和5.00 mL 稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5 mL 鹽酸溶液和5.00 mL 稀碘液為空白，于660 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光度(A)。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式y(tǒng)=0.8475x-0.0145，假設(shè)y0為空白對(duì)照樣淀粉濃度，y 為待測(cè)樣淀粉濃度。代入公式計(jì)算反應(yīng)過程中淀粉的消耗量，y0-y=0.8475(x0-x），根據(jù)α-淀粉酶活力定義計(jì)算α-淀粉酶活力X：

式中：X——樣品的酶活力，U/mL；

c——測(cè)試酶樣濃度，g/mL；

v——反應(yīng)中加入待測(cè)酶液量，mL；

t——反應(yīng)時(shí)間，(min)。

式中c=0.1 g/mL；v=1.00 mL；t=10 min。

2 結(jié)果與分析

為了比較兩種檢測(cè)方法的優(yōu)劣，我們隨機(jī)選取原料車間粉碎好的兩個(gè)高溫曲樣作為試驗(yàn)樣品，分別從反應(yīng)所需時(shí)間和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度方面進(jìn)行比較。

2.1 反應(yīng)時(shí)間

2.1.1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法的反應(yīng)時(shí)間

由1.2.2 可知，前期準(zhǔn)備工作除外，固體曲浸出液的制備需要120 min，液化所需時(shí)間跟成品曲液化力大小相關(guān)。根據(jù)1.2.3 固體曲液化力的計(jì)算公式，由于試驗(yàn)的是高溫曲，式中v=2 mL，代入公式計(jì)算。而白云邊公司高溫曲液化力的檢驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)是0.2～0.6 g/g·h。而當(dāng)液化力為0.2 g/g·h 時(shí)，反應(yīng)時(shí)間t 為150 min；當(dāng)液化力為0.6 g/g·h 時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為50 min。假設(shè)前期準(zhǔn)備工作和中途液化反應(yīng)液的制備共需要30 min，那么合格曲的液化力檢測(cè)時(shí)間在200～300 min 之間，成品曲入庫之前，會(huì)有部分液化力偏低的不合格曲，這些不合格曲的檢測(cè)時(shí)間更長(zhǎng)。

2.1.2 分光光度計(jì)法的反應(yīng)時(shí)間

分光光度計(jì)法測(cè)定酶活中前期藥品配制等準(zhǔn)備工作除外，假設(shè)大曲粉浸提前的準(zhǔn)備工作需要15 min，淀粉溶液的配制等準(zhǔn)備工作可以在酶液提取的過程中進(jìn)行，酶液提取時(shí)間2 h，預(yù)熱反應(yīng)8 min，酶解10 min，最后測(cè)定吸光度，檢測(cè)時(shí)間5 min。分光光度法測(cè)定酶活，耗時(shí)158 min。因?yàn)榉磻?yīng)底物濃度的變化由吸光度大小決定。所以無論成品曲液化力多少，反應(yīng)時(shí)間都是固定的。

2.2 比較檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度

將試驗(yàn)曲分別設(shè)為樣品1 和樣品2。為了比較兩種檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，分別用傳統(tǒng)法和分光光度法兩種試驗(yàn)方法檢測(cè)，即稱為方法一和方法二。每種方法測(cè)定了7 組數(shù)據(jù)。測(cè)定結(jié)果見表1和表2。

2.2.1 準(zhǔn)確度的比較

準(zhǔn)確度是指測(cè)量值與真實(shí)值之間相符合的程度。準(zhǔn)確度的高低常以誤差的大小來衡量。即誤差越小，準(zhǔn)確度越高；誤差越大，準(zhǔn)確度越低。由于樣本的真實(shí)值是不可知的，在日常分析工作中，需對(duì)試樣作平行測(cè)定，取其算術(shù)平均值作為真實(shí)值。從表1 可知，用方法一測(cè)得樣品1 液化力的平均值為0.432 g/g·h，可以作為方法一測(cè)得的真實(shí)值用于計(jì)算該組數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差。用方法二測(cè)得樣品1酶活力的平均值為0.584 U/mL，可以作為方法二測(cè)得的真實(shí)值用于計(jì)算該組數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差。同理，表2 中樣品2 液化力的平均值為0.251 g/g·h，酶活力的平均值為0.385 U/mL。均可作為這兩組數(shù)據(jù)的真實(shí)值計(jì)算相對(duì)誤差。相對(duì)誤差是指誤差在真實(shí)值中所占的百分率。相對(duì)誤差的表示方法是：

表1 樣品1兩種試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表

表2 樣品2兩種試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表

樣品1 和樣品2 兩種方法測(cè)定相對(duì)誤差結(jié)果對(duì)比柱形圖見圖2、圖3。由圖2 和圖3 可以看出，無論是樣品1 還是樣品2，用傳統(tǒng)檢測(cè)法測(cè)定的相對(duì)誤差值明顯要比分光光度法大。也就是說分光光度法測(cè)定成品曲酶活力的準(zhǔn)確度要顯著高于傳統(tǒng)測(cè)液化力方法。（注：柱形圖的比較更具直觀性，數(shù)據(jù)處理時(shí)按大小順序排列，并非測(cè)量先后順序。）

2.2.2 精密度的比較

精密度是指在相同條件下n 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果彼此相符合的程度。精密度的大小用偏差表示，偏差愈小，說明精密度愈高。絕對(duì)偏差表示單個(gè)樣本的精密度，用測(cè)定值減平均值來表示。

圖2 樣品1兩種方法測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差對(duì)比圖

圖3 樣品2兩種方法測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差對(duì)比圖

在數(shù)理統(tǒng)計(jì)中，一般測(cè)定次數(shù)有限，常用樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示精密度，其數(shù)學(xué)表達(dá)式（貝塞爾公式）為：

式中xi為單個(gè)樣本值為樣本平均值。（n-1）在統(tǒng)計(jì)學(xué)中稱為自由度，意思是在n 次測(cè)量中，只有（n-1）個(gè)獨(dú)立可變的偏差，因?yàn)閚 個(gè)絕對(duì)偏差之和等于零，所以只要知道（n-1）個(gè)絕對(duì)偏差，就可以確定第n個(gè)的偏差值。

通過表3 和表4 的絕對(duì)偏差值（xi）代入貝賽爾公式計(jì)算。

樣品1樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）分別為：

表3 樣品1測(cè)定值絕對(duì)偏差對(duì)照表

表4 樣品2測(cè)定值絕對(duì)偏差對(duì)照表

樣品2的樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）分別為：

比較兩個(gè)樣品分別用傳統(tǒng)方法和分光光度法檢測(cè)數(shù)據(jù)的樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差S1和S2可以說明使用分光光度法檢測(cè)所得數(shù)據(jù)的精密度高。因?yàn)樵摻M數(shù)據(jù)較集中并接近標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。由此可見，欲使準(zhǔn)確度高，首先必須要求精密度也高，但精密度高并不說明準(zhǔn)確度也高，因?yàn)榭赡茉跍y(cè)定中存在系統(tǒng)誤差，但精密度是保證準(zhǔn)確度的先決條件。

3 討論與結(jié)論

3.1 反應(yīng)時(shí)間

分光光度法檢測(cè)大曲粉酶活力反應(yīng)時(shí)間需要158 min。傳統(tǒng)液化力檢測(cè)法反應(yīng)時(shí)間和測(cè)試所用成品曲的液化力相關(guān)，合格曲的液化力檢測(cè)時(shí)間在200～300 min 之間，液化力偏低的不合格曲的檢測(cè)時(shí)間更長(zhǎng)。兩種檢測(cè)方法反應(yīng)原理相同，都是通過在一定溫度下發(fā)生酶解反應(yīng)，使碘遇淀粉呈現(xiàn)的藍(lán)紫色反應(yīng)逐漸消失，其顏色消失的速度與測(cè)定的液化酶活力是相關(guān)的。傳統(tǒng)檢測(cè)法需要等待淀粉酶將淀粉徹底酶解至藍(lán)紫色消失，這與測(cè)試樣的液化力相關(guān)，所以耗時(shí)長(zhǎng)。而分光光度法則是讓待測(cè)試樣統(tǒng)一反應(yīng)10 min后，利用分光光度計(jì)檢測(cè)試樣顏色深淺的變化，即利用試樣顏色消失的速度來衡量酶活力的高低，通過反應(yīng)后的吸光度計(jì)算酶活力。這樣會(huì)大大縮短檢測(cè)時(shí)間。

3.2 測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度

通過圖1 和圖2 可知，傳統(tǒng)檢測(cè)法的相對(duì)誤差要明顯高于分光光度法。而準(zhǔn)確度的高低用相對(duì)誤差來衡量。所以分光光度法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度高于傳統(tǒng)檢測(cè)法。通過比較利用兩種方法檢測(cè)的樣品1 和樣品2 的樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差S1和S2可以說明，使用分光光度法檢測(cè)所得數(shù)據(jù)的精密度高。因?yàn)閭鹘y(tǒng)檢測(cè)法是定時(shí)取出一滴反應(yīng)液于加入裝有稀碘液的試管內(nèi)，觀察顏色變化，我們?cè)囼?yàn)中是待顏色變淺時(shí)每隔2 min 測(cè)試一遍，測(cè)試也需要間隔時(shí)間，所以間隔時(shí)間不能再縮短，而遇到液化力大的試樣，顏色變化極快，仍然會(huì)帶來時(shí)間上的延遲誤差。且肉眼觀察，也會(huì)帶來終點(diǎn)顏色的判斷誤差。而分光光度法可以避免上述誤差的出現(xiàn)。

俗話說：“曲乃酒之骨?！贝笄鷮?duì)白酒產(chǎn)量和質(zhì)量起著決定性作用。其淀粉酶活力直接影響酒醅中淀粉的轉(zhuǎn)化率及出酒率。準(zhǔn)確測(cè)定大曲淀粉酶活力，生產(chǎn)中合理配比成曲用量至關(guān)重要。分光光度法測(cè)定酶活力相比傳統(tǒng)液化力檢測(cè)法既快速又準(zhǔn)確?，F(xiàn)代科技進(jìn)步日新月異，先進(jìn)的檢測(cè)方法必將逐漸取代傳統(tǒng)檢測(cè)法。