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        響應(yīng)面分析法優(yōu)化一株窖泥源酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)RL1菌株產(chǎn)丁酸發(fā)酵培養(yǎng)基

        2019-11-12 02:29:40彭志云胡曉龍何培新牛廣杰
        釀酒科技 2019年10期
        關(guān)鍵詞:丁酸碳酸鈣發(fā)酵液

        彭志云,趙 東,胡曉龍,何培新,張 勇,鄭 燕,牛廣杰

        (1.宜賓五糧液股份有限公司,四川宜賓 644007;2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450001;3.河南省百泉春酒業(yè)有限公司,河南新鄉(xiāng) 453000)

        丁酸(Butyric Acid)是一種重要的四碳短鏈有機(jī)酸,廣泛地應(yīng)用于化工、食品和制藥等行業(yè)。丁酸及其衍生物有多種用途,比如,丁酸可作為生產(chǎn)塑料和纖維制品的添加劑以增加其柔韌性、疏水性和耐光性[1],也可以通過生物轉(zhuǎn)化為丁醇來緩解石油能源枯竭和日益增長的需求壓力,是一種具有巨大潛力的能源物質(zhì);丁酸酯可作為飲料、食品以及化妝品中的果味香料[2];丁酸在胰島素抵抗以及血紅蛋白病和直腸癌的治療等方面的應(yīng)用具有很大潛力[3-5]。厭氧條件下,丁酸可以由不同種屬細(xì)菌菌株產(chǎn)生,而梭菌屬由于具有較高的丁酸產(chǎn)率和產(chǎn)量被選作丁酸生產(chǎn)的優(yōu)勢種屬,目前用于工業(yè)化研究的梭菌屬細(xì)菌主要有C.tyrobutyricum[6-12]、C.butyricum[13-15]和C.thermobutyricum[16],而C.tyrobutyricum因能夠產(chǎn)生高濃度丁酸且具有高酸耐受性、高選擇性等優(yōu)勢,成為丁酸工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)研究的最佳菌株。

        響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)是一種開發(fā)、改進(jìn)和優(yōu)化多個(gè)變量對目標(biāo)物響應(yīng)變化的有力工具,它將統(tǒng)計(jì)學(xué)與數(shù)學(xué)相結(jié)合,通過建立和分析回歸方程來量化目標(biāo)產(chǎn)物特性與過程變量之間的函數(shù)關(guān)系[17]。與單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相比,RSM 不僅能夠研究變量之間的交互作用,而且因?yàn)樵囼?yàn)次數(shù)少、周期短、回歸方程精確度高等優(yōu)勢廣泛地應(yīng)用于生物、化工、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

        培養(yǎng)基是微生物生長和發(fā)酵的基礎(chǔ),培養(yǎng)基中的成分和濃度對丁酸的生產(chǎn)具有很大影響,本研究采用響應(yīng)面法來優(yōu)化C.tyrobutyricumRL1 發(fā)酵培養(yǎng)基來提高丁酸的產(chǎn)量,首先通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基中的9 個(gè)主要因素進(jìn)行篩選,找出影響丁酸產(chǎn)量的顯著因素,再利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域,最后通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)及響應(yīng)值分析來確定顯著影響因素的最佳濃度,從而獲得C.tyrobutyricumRL1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑及儀器

        1.1.1 供試菌株

        C.tyrobutyricumRL1,本實(shí)驗(yàn)室前期從窖泥中分離保存。

        1.1.2 主要試劑

        丁酸、2-乙基丁酸(色譜純),購自日本TCI 公司;其余試劑均為市售分析純。

        1.1.3 主要儀器

        立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS),上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(SW-CJ-ID 型),蘇州凈化設(shè)備有限公司;厭氧產(chǎn)氣袋(C-11)、培養(yǎng)袋(C-41),日本三菱;智能生化培養(yǎng)箱(SHP-250),上海鴻都電子科技有限公司;電子天平(ME204E),梅特勒-托利多儀器有限公司;離心機(jī)TGL-16G,上海安亭科學(xué)儀器廠;氣相色譜儀(7820A)和HP-INNOWAX 毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.255 mm×0.25 μm),美國安捷倫公司。

        1.1.4 培養(yǎng)基的制備

        種子活化培養(yǎng)基:即增強(qiáng)梭菌培養(yǎng)基(RCM 培養(yǎng)基),參照Hu[18]文獻(xiàn)中報(bào)道的方法配制。

        基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30,酵母粉5,蛋白胨5,氯化鈉5,乙酸鈉3,磷酸氫二鉀2.5,七水合硫酸鎂0.6,硫酸銨3,七水合硫酸亞鐵0.03,硫代乙醇酸鈉0.5,碳酸鈣5,pH6.8,121 ℃滅菌20 min,培養(yǎng)基中葡萄糖和碳酸鈣均與其他組分分開滅菌,于接種前加入。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 RL1菌株種子的活化和培養(yǎng)方法

        取-20 ℃甘油保藏的菌懸液300 μL 接種于裝有10 mL 種子活化培養(yǎng)基的試管中,于添加除氧劑的厭氧袋中34 ℃厭氧活化培養(yǎng)24 h,作為一級種子。將一級種子以3 %(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至工作體積為100 mL 且裝液量同為100 mL 的厭氧瓶中(在RL1 產(chǎn)氣后接入無菌輸液管用于排氣),34 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,作為二級種子。將活化好的二級種子以3 %(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至上述同樣條件的厭氧瓶中,34 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h。

        1.2.2 發(fā)酵液前處理

        取培養(yǎng)72 h 的發(fā)酵液15 mL,10000 r/min 離心10 min 去除菌絲體及碳酸鈣,取10 mL 稀釋適當(dāng)倍數(shù)的上清液,加25 μL 72 %硫酸進(jìn)行酸解,使上清液中的有機(jī)酸游離出來,加入40 μL 2-乙基丁酸作為內(nèi)標(biāo)充分混勻,乙醚萃取,再用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾即得待測液。

        1.2.3 發(fā)酵液中丁酸濃度的定量分析

        發(fā)酵液中丁酸濃度的檢測采用氣相色譜(GC)和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

        1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        用RCM 培養(yǎng)基準(zhǔn)確配制50 mg/mL 的丁酸母液,并依次稀釋配成8 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)濃度平行3次)。每個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液取10 mL,加入40 μL 2-乙基丁酸(內(nèi)標(biāo))充分混勻,乙醚萃取,經(jīng)孔徑為0.22 μm 微孔濾膜過濾,上樣。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo),丁酸與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

        1.2.3.2 色譜條件

        采用安捷倫7820A 氣相色譜儀進(jìn)行丁酸濃度檢測。色譜條件參照陳興杰等的報(bào)道[19]并稍作修改:進(jìn)樣口溫度200 ℃,柱箱起始溫度100 ℃,保持1 min,以10 ℃/min 的升溫速率升溫至220 ℃,保持2 min。檢測器溫度250 ℃;氣體流量:氫氣35 mL/min,空氣400 mL/min,尾吹氣20 mL/min;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣,分流比為20∶1;進(jìn)樣體積:1 μL。

        1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        1.2.4.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

        利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)考察基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的9 個(gè)成分對RL1 產(chǎn)丁酸的影響。通過Design-Expert.8.05b 軟件對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì),選取試驗(yàn)次數(shù)N=12 的設(shè)計(jì)方案,考察因素及編碼值分別為葡萄糖(X1)、酵母粉(X2)、蛋白胨(X3)、乙酸鈉(X4)、氯化鈉(X5)、七水合硫酸鎂(X6)、硫酸銨(X7)、七水合硫酸亞鐵(X8)和碳酸鈣(X9),每個(gè)因素選取高低兩個(gè)水平,分別用+1和-1表示。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。

        1.2.4.2 最陡爬坡試驗(yàn)

        響應(yīng)面擬合方程需要建立在最佳值區(qū)域附近才能充分反映真實(shí)情形。最陡爬坡試驗(yàn)是一種能夠快速有效地接近最佳響應(yīng)區(qū)域的試驗(yàn)方法,它以Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)擬合模型為基礎(chǔ),根據(jù)顯著因素效應(yīng)的正負(fù)及大小來設(shè)定爬坡方向及變化步長,而其他非顯著因素既可根據(jù)效應(yīng)的正負(fù)和大小設(shè)定(例如表現(xiàn)為正效應(yīng)的因素均取較高值,負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值),也可從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)選取較低值。

        1.2.4.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)

        響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology,RSM)是一種解決多變量問題的常用統(tǒng)計(jì)方法,它通過合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出相應(yīng)的數(shù)據(jù)并建立多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系從而確定最佳工藝參數(shù)。

        根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)找出試驗(yàn)的顯著因素與水平,采用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)對發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。每個(gè)因素取低中高3 個(gè)水平,編碼為(-1,0,1),試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果分析均采用軟件Design-Expert.8.05b。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        將配制好的不同濃度的丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述方法處理并進(jìn)行氣相色譜檢測,每個(gè)濃度做3 個(gè)平行樣品。取丁酸和2-乙基丁酸峰面積比的平均值,以丁酸濃度(g/L)為縱坐標(biāo),丁酸與2-乙基丁酸的峰面積之比(A/A)為橫坐標(biāo)作圖(圖1),得到丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.9716x+0.4495(R2=0.9987,n=5)。

        圖1 丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選顯著影響因素

        把發(fā)酵液中的丁酸濃度(g/L)作為因變量,采用Plackett-Burman 試驗(yàn)研究培養(yǎng)基中各組分對RL1 產(chǎn)丁酸的影響,篩選出對丁酸生成影響顯著的因素。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。利用Design-Expert 8.05b 軟件對表1 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Plaekett-Burman 試驗(yàn)中各因素水平的濃度以及顯著性分析結(jié)果如表2 所示。由表中信息可知,整體模型顯著,且在α=0.05 的顯著水平上,對丁酸生成影響顯著的3 個(gè)因素分別是葡萄糖(X1)、碳酸鈣(X9)、蛋白胨(X3)。選取這3個(gè)因素進(jìn)行下一步操作試驗(yàn)。

        表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

        表2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

        2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

        對Plackett-Burman 的試驗(yàn)結(jié)果分析找出對丁酸生成影響不顯著的因素,其中起正效應(yīng)作用的酵母粉、乙酸鈉和氯化鈉取高水平值,起負(fù)效應(yīng)的七水合硫酸鎂、硫酸銨和七水合硫酸亞鐵取低水平值。對丁酸生成具有顯著正效應(yīng)作用的葡萄糖、碳酸鈣和蛋白胨的變化方向以及步長的設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

        2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)篩選顯著因素的最佳濃度

        2.4.1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

        通過Plackett-Burman 試驗(yàn)確定對丁酸生成影響顯著的因素,再由最陡爬坡試驗(yàn)確定其接近響應(yīng)值區(qū)時(shí)的濃度,最后采用Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析,顯著因素的水平見表4,Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果見表5。

        表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 (g/L)

        表4 響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)水平表

        以發(fā)酵液中丁酸濃度為響應(yīng)值,利用Design-Expert.8.05b 軟件對表5 中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析,得到的回歸分析模型方程為:

        表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

        該模型可信度分析結(jié)果及模型回歸方程的方差分析分別見表6和表7。

        表6 模型可信度分析

        表7 回歸方程的方差分析表

        模型可信度分析見表6,其中決定系數(shù)R2=0.9921,表明該模型可以解釋99.21 %試驗(yàn)中響應(yīng)值的變化,方程擬合度較高。變異系數(shù)可以衡量試驗(yàn)中各觀測值變異程度的大小,其值越低,試驗(yàn)的可靠性越高。本試驗(yàn)中CV=1.27%,數(shù)值較低,說明試驗(yàn)操作的準(zhǔn)確度較高,操作可信。信噪比是判斷模型是否能夠提供充足信息以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的一個(gè)重要參數(shù),當(dāng)信噪比大于4 時(shí),可以認(rèn)為模型能提供足夠的信號,本試驗(yàn)中信噪比為24.021,符合分析所需要求。綜上表明,該模型可信度較高,可以用來分析和預(yù)測RL1的最佳培養(yǎng)基成分。

        由表7 可知,該多元二次回歸方程模型的顯著性檢驗(yàn)P=0.0001,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.05,表明該模型具有良好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自變量X1、X2及二次項(xiàng)X1X2、X2X3、X12、X22、X32相關(guān)系數(shù)的P<0.05,表明這些因素以及因素之間的交互作用會顯著影響發(fā)酵液中丁酸的生成。失擬項(xiàng)代表試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型的擬合程度,本試驗(yàn)P=0.5439>0.05,失擬不顯著,因此該回歸方程可以代替真實(shí)數(shù)據(jù)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

        2.4.2 響應(yīng)面與等高線

        保持3 個(gè)因素中任一因素處于中間值不變,可以分析剩余兩個(gè)因素之間的相互作用。利用Design-Expert.8.05b 軟件繪制響應(yīng)面分析圖及等高線,葡萄糖與蛋白胨、葡萄糖與碳酸鈣以及蛋白胨與碳酸鈣之間的交互作用對響應(yīng)值的影響分別見圖2、圖3、圖4。

        葡萄糖是RL1 發(fā)酵產(chǎn)丁酸的物質(zhì)基礎(chǔ)。由圖2、圖3 可知,在一定范圍內(nèi),發(fā)酵液中的丁酸濃度隨著葡萄糖濃度的增加不斷升高,當(dāng)葡萄糖濃度大于85.29 g/L時(shí),丁酸濃度不再升高且隨著葡萄糖濃度的增加逐漸降低,丁酸的合成受到抑制。其原因可能是,RL1 主要利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)丁酸,葡萄糖濃度越高,對丁酸的生成越有利,但隨著發(fā)酵過程中丁酸濃度的不斷增加,培養(yǎng)基中的pH 值一直降低,當(dāng)pH 值降低到某個(gè)特定值時(shí),菌體的生長以及代謝產(chǎn)物的生成開始受到抑制,而且這種抑制作用隨著發(fā)酵的進(jìn)行不斷增強(qiáng)。此外,葡萄糖的過度代謝也會加速其他酸性副產(chǎn)物(如乙酸等)的積累,導(dǎo)致pH值迅速降低。

        圖2 葡萄糖和蛋白胨對丁酸生產(chǎn)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

        圖3 葡萄糖和碳酸鈣對丁酸生產(chǎn)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

        圖4 蛋白胨和碳酸鈣對丁酸生產(chǎn)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

        氮源是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)、核酸及其他含氮化合物的基礎(chǔ),在微生物生長代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。蛋白胨含有豐富的氮源、氨基酸等,是微生物發(fā)酵常用且重要的氮源物質(zhì),但是過量的蛋白胨也會抑制丁酸的生成,由圖2和圖4可知,當(dāng)?shù)鞍纂藵舛却笥?.37 g/L時(shí),隨著蛋白胨濃度的增加,丁酸濃度逐漸降低。

        微生物生長過程中pH 值對菌株生長和代謝有至關(guān)重要的作用。隨著RL1 利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸的進(jìn)行,培養(yǎng)基中的pH 值開始逐漸降低,菌體生長越旺盛,產(chǎn)酸越多,pH 值降低得越快,因此在培養(yǎng)基中添加一定量的碳酸鈣,不僅可以給微生物提供微量鈣元素還可以對發(fā)酵過程中的pH 值的變化起緩沖作用,避免發(fā)酵液pH 值劇烈降低。由圖3、圖4 可知,當(dāng)碳酸鈣的添加量低于11.6 g/L 時(shí),隨著其添加量的增加,丁酸濃度逐漸增加,當(dāng)達(dá)到11.6 g/L后,丁酸濃度不再上升,并開始降低,表明此時(shí)的碳酸鈣已經(jīng)接近最大緩沖能力,增加碳酸鈣的添加量不僅不能緩解pH 值的降低,微溶于發(fā)酵液中過量的鈣離子也開始對丁酸的生成形成抑制作用。

        綜合以上分析,當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨、碳酸鈣的添加量分別為85.29 g/L、9.37 g/L 和11.6 g/L時(shí),丁酸濃度達(dá)最大值。應(yīng)用軟件深入分析,預(yù)測在這種情況下發(fā)酵液中丁酸的最大濃度為23.09 g/L。為檢驗(yàn)?zāi)P涂煽啃?,分別在優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基上進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上RL1 所產(chǎn)丁酸濃度為14.23 g/L,而最佳培養(yǎng)基上的丁酸濃度為22.96 g/L。試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測值接近,說明該模型可以真實(shí)地反映培養(yǎng)基中的主要組分對丁酸生成量的影響,且優(yōu)化后較優(yōu)化前丁酸濃度提高了61.35%。

        3 結(jié)論

        采用響應(yīng)面分析法對RL1 產(chǎn)丁酸培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。首先采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基中的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、乙酸鈉、氯化鈉、七水合硫酸鎂、硫酸銨、七水合硫酸亞鐵、碳酸鈣9 個(gè)因素進(jìn)行篩選,確定出葡萄糖、碳酸鈣和蛋白胨是影響丁酸生成的顯著因素。改變3 種顯著因素的濃度,利用最陡爬坡路徑逼近最大產(chǎn)酸響應(yīng)區(qū)域,通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值分析確定出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):葡萄糖85.29,酵母粉7.5,蛋白胨9.37,氯化鈉7.5,乙酸鈉4.5,磷酸氫二鉀2.5,硫酸鎂0.3,硫酸銨1.5,硫酸亞鐵0.015,硫代乙醇酸鈉0.5,碳酸鈣11.6,此時(shí)丁酸濃度最大預(yù)測值為23.09 g/L。對模型準(zhǔn)確性進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,得到的實(shí)際濃度為22.96 g/L,培養(yǎng)基優(yōu)化后的丁酸濃度較優(yōu)化前的14.23 g/L提高了61.35%,優(yōu)化效果顯著。

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