石蓮 任軼杰 奚瑩 石蕾 郭晨 關(guān)建

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性呼吸系統(tǒng)傳染病，嚴(yán)重危害人類健康。中國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，在肺結(jié)核患者中細(xì)菌學(xué)確診的患者占32%。同時在登記的肺結(jié)核患者中估算的耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)患者約5.8萬例，通過實驗室確診的的患者例數(shù)僅1.3萬例[1]。目前常用的結(jié)核病診斷技術(shù)包括：涂片鏡檢，MTB培養(yǎng)[包括BACTEC MGIT 960分枝桿菌液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)”)和羅氏固體培養(yǎng)]和快速分子生物學(xué)檢測，如GeneXpert MTB/RIF檢測(簡稱“GeneXpert”)。本研究選擇了2016年10月至2018年2月的涂片陽性疑似結(jié)核病患者，比較MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert檢測和熒光PCR熔解曲線技術(shù)三種方法對涂片陽性的結(jié)核病患者的檢測效能，同時進行耐藥性分析，為三種診斷方法的臨床應(yīng)用提供參考。

對象和方法

一、研究對象

收集2016年10月至2018年2月在沈陽市胸科醫(yī)院收治的411例涂片陽性患者，經(jīng)MTB抗原檢測(MPB64檢測)陽性并符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診肺結(jié)核患者392例，進行回顧性分析。其中，男329例，占80.05%；女82例，占19.95%；年齡13～92歲，平均年齡(50.9±15.1)歲。經(jīng)MPB64檢測陰性且經(jīng)基因芯片菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌感染患者19例，分別為膿腫分枝桿菌6例，堪薩斯分枝桿菌4例，胞內(nèi)分枝桿菌9例。

二、方法

所有患者入院后先進行涂片檢測，涂片陽性患者一周內(nèi)采集一份痰標(biāo)本分別進行MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert 檢測和熒光PCR熔解曲線檢測。痰標(biāo)本為患者漱口后的痰液標(biāo)本，至少4 ml。根據(jù)國家結(jié)核病參比實驗室《結(jié)核病實驗室檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化操作示意圖集》進行樣本預(yù)處理后，分別進行MGIT 960液體培養(yǎng)，GeneXpert 檢測和熒光PCR熔解曲線技術(shù)檢測。

1. MGIT 960培養(yǎng)：取1 ml的痰液樣本按照MGIT 960系統(tǒng)操作說明書進行樣本處理，液體培養(yǎng)時間設(shè)定為42 d。儀器自動報告陽性后，取培養(yǎng)液涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽性；若未見抗酸桿菌則為陰性。陽性菌株再進行利福平(RFP，40 μg/ml)、異煙肼(INH，0.2 μg/ml)，左氧氟沙星(Lfx，4.0 μg/ml)和阿米卡星(Am,1.0 μg/ml)的MGIT 960液體藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，各藥物濃度參照《結(jié)核病實驗室技術(shù)手冊》。

2.GeneXpert 檢測：取1 ml痰液置于有螺旋蓋的前處理管中，加入相當(dāng)于2倍痰標(biāo)本體積的樣本處理液，旋緊管蓋，在渦旋振蕩器上渦旋混勻15～30 s，室溫靜置15 min，確保樣本充分液化。吸取2 ml 處理后的樣本從加樣孔緩慢加入反應(yīng)試劑盒，將試劑盒置于GeneXpert 檢測系統(tǒng)模塊中，儀器開始進行自動化檢測。約2 h反應(yīng)結(jié)束后，在軟件中直接查看檢測結(jié)果。GeneXpert 用5條分子信標(biāo)探針將81 bp的利福平耐藥核心區(qū)間以全部覆蓋的方法進行檢測，第6條探針作為內(nèi)對照。當(dāng)樣本中不存在MTB時，分子信標(biāo)探針無法與目標(biāo)序列配對結(jié)合，分子信標(biāo)仍然呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，4條或5條探針均無熒光釋放，而作為內(nèi)對照的探針被檢測出來，結(jié)果判定為MTB陰性。當(dāng)樣本中存在對RFP敏感的MTB時，5條分子信標(biāo)探針特異性地與目標(biāo)靶序列配對結(jié)合且均釋放熒光，結(jié)果判定為MTB陽性，且RFP敏感。當(dāng)樣本中存在對RFP耐藥的MTB時，目標(biāo)靶序列上某個位點產(chǎn)生突變，5條分子信標(biāo)探針中的1條或幾條不能很好地與之結(jié)合，儀器檢出少于5條探針，結(jié)果為MTB陽性，且RFP耐藥。

3.熒光PCR熔解曲線技術(shù)檢測：取1.5 ml痰液置于帶有螺旋蓋的前處理管中，加入1～2倍體積4% NaOH，渦旋振蕩1 min，待痰液充分液化，3000×g離心10 min，去掉上清收集沉淀，加入500 μl 配制好的DNA提取液采用磁珠法提取樣本DNA，待DNA提取完成后，配制試劑構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，對DNA進行熒光PCR熔解曲線法分析判斷結(jié)果。采用熔解曲線法檢測RFP、INH、Am、氟喹諾酮類藥物(FQ)耐藥基因突變情況。RFP檢測區(qū)域為rpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)利福平耐藥決定區(qū)81 bp的突變情況；INH檢測區(qū)域為ahpC啟動子區(qū)(-44～-30以及-15～3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8 位點)以及katG315密碼子的突變情況；Am檢測區(qū)域為rrs1401和rrs1484位點的突變情況；FQ檢測區(qū)域為gyrA基因88～94位密碼子的突變情況。結(jié)果通過軟件判讀，當(dāng)樣本與陽性對照Tm值一致時判定為敏感菌，ΔTm值≥2 ℃時判定為耐藥菌，提示該菌株對此藥物耐藥[2]。

三、 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。一致性比較采用Kappa檢驗，Kappa值>0.75認(rèn)為兩者一致性較好，0.4

結(jié) 果

一、三種檢測方法在涂陽肺結(jié)核患者中的檢測效能

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，在411例涂片陽性患者(其中392例診斷為肺結(jié)核，19例診斷為非結(jié)核分枝桿菌感染)痰標(biāo)本中， GeneXpert檢測的敏感度和陰性預(yù)測值最高，其次為MGIT 960培養(yǎng)，熒光PCR熔解曲線技術(shù)略低于其他兩種方法。三種方法檢測的特異度和陽性預(yù)測值均可達到100.00%，具體見表1。

二、三種檢測方法對耐藥性檢測的一致性分析

在三種方法檢測的涂片陽性肺結(jié)核患者中進行耐藥性檢測，其中MGIT 960培養(yǎng)檢出耐藥202例(含任意一種藥耐藥)，GeneXpert 檢出RFP耐藥144例，熒光PCR熔解曲線技術(shù)檢出耐藥181例(含任意一種藥耐藥)。以比例法藥敏試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，三種方法共檢出RFP單耐藥12例，RFP和INH同時耐藥的耐多藥患者108例。

以比例法藥敏試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，在347例改良羅氏培養(yǎng)陽性樣本中(377例改良羅氏培養(yǎng)陽性樣本中剔除1例GeneXpert陰性樣本，剔除29例熒光PCR熔解曲線技術(shù)陰性樣本)，GeneXpert對RFP耐藥檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為94.44%(119/126)、96.83%(214/221)、94.44%(119/126)、96.83%(214/221)，與比例法藥敏試驗結(jié)果的一致性較好，Kappa值為0.917。

以比例法藥敏試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線技術(shù)對檢測RFP耐藥的敏感度、特異度分別為94.44%和95.47%，一致性較好，Kappa值為0.895。對檢測INH和Lfx耐藥的敏感度和特異度分別為74.84%、97.92%和83.33%、93.00%，一致性較好，Kappa值分別為0.744和0.755。見表2。

以比例法藥敏試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，MGIT 960法對RFP耐藥檢測的敏感度、特異度分別為96.03%、96.38%，對INH耐藥檢測的敏感度、特異度分別為98.06%、98.44%，一致性較好，Kappa值分別為0.919、0.965，見表3。

表1 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)三種檢測方法對涂陽肺結(jié)核的檢測效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表2 熒光PCR熔解曲線耐藥基因檢測與比例法藥敏試驗?zāi)退幮詸z測的一致性分析

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表3 MGIT 960培養(yǎng)與比例法藥敏試驗?zāi)退幮詸z測的一致性分析

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

討 論

傳統(tǒng)的MTB檢測技術(shù)主要以痰涂片和培養(yǎng)為主，固體培養(yǎng)及藥敏試驗耗時長，通常需要2～3個月，無法達到對結(jié)核病患者的及時發(fā)現(xiàn)和合理治療的目的[3]。隨著現(xiàn)代檢測技術(shù)的發(fā)展，液體培養(yǎng)的出現(xiàn)將MTB培養(yǎng)時間縮短至15～30 d，陽性樣本報告時間較固體培養(yǎng)明顯縮短，并有研究表明液體培養(yǎng)具有比固體培養(yǎng)更高的準(zhǔn)確性[4]。分子生物學(xué)技術(shù)通過體外提取擴增檢測MTB DNA和相應(yīng)的耐藥相關(guān)基因，使利福平耐藥/耐多藥肺結(jié)核患者可以在一周內(nèi)甚至當(dāng)天獲得病原學(xué)和藥敏試驗結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)GeneXpert在替代涂片作為初始診斷時檢測MTB的敏感度為88%，特異度為99%，被WHO推薦用于成人和兒童肺結(jié)核及肺外結(jié)核和疑似耐藥結(jié)核病患者的檢測[5]。熒光PCR熔解曲線技術(shù)可檢測2種一線藥物和2種二線藥物的耐藥基因，對耐多藥/廣泛耐藥肺結(jié)核患者早期診斷及治療具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，分析了MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert和熒光PCR熔解曲線技術(shù)在痰涂片陽性樣本中的檢測效能，其中GeneXpert檢測的敏感度和陰性預(yù)測值最高，其次是MGIT 960培養(yǎng)，熒光PCR熔解曲線技術(shù)略低于其他兩種方法。GeneXpert采用半巢式實時熒光PCR法，從DNA提取到擴增檢測均在密閉試劑盒內(nèi)自動完成，敏感度和特異度較傳統(tǒng)PCR技術(shù)有了很大程度的提高，在多種類型樣本檢測中均有研究表明GeneXpert 檢測的敏感度高于其他方法[6-9]。熒光PCR熔解曲線技術(shù)通過分析DNA熔解溫度來判斷是否檢出和突變，本研究發(fā)現(xiàn)該方法檢測的敏感度低于GeneXpert，原因主要在于其手工操作過程繁瑣，在操作過程中導(dǎo)致DNA提取不完全和DNA的流失[10]。雖然熒光PCR熔解曲線技術(shù)檢測的敏感度較低，但同時可檢測4種藥物耐藥，大大縮短了廣泛耐藥結(jié)核病的診斷時間，為廣泛耐藥結(jié)核病的診斷提供了新的快速診斷方法。由于本研究納入的患者并未區(qū)分初治和復(fù)治患者，對于復(fù)治患者可能會因用藥導(dǎo)致MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為陰性，這也是導(dǎo)致MGIT 960培養(yǎng)檢測的敏感度略低于GeneXpert的一個原因。

本研究以比例法藥敏試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，比較了三種方法與改良羅氏培養(yǎng)藥敏檢測的一致性。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的分子機制有以下兩點：(1)染色體的基因突變包括點突變、多位點聯(lián)合突變等是導(dǎo)致藥物耐藥最重要的基礎(chǔ)，由于基因的突變改變了藥物作用的靶點，使藥物對細(xì)菌的敏感性下降，從而導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生；(2) MTB具有的藥物主動外排泵機制是導(dǎo)致耐藥的另一個原因[11]。本研究MGIT 960培養(yǎng)檢測和熒光PCR熔解曲線技術(shù)對RFP耐藥檢測的敏感度相近，分別為96.03%和94.44%，MGIT 960培養(yǎng)檢測的特異度略高于PCR熔解曲線技術(shù)，分別為96.38%和95.47%，這主要是由于95%的RFP耐藥菌株是因rpoB基因中第507～533位的27個氨基酸位點發(fā)生了突變[12]，因此在基因突變水平上檢測RFP是否耐藥與表型藥敏試驗結(jié)果一致性較高，利用分子檢測rpoB基因的突變可更快地幫助RFP耐藥患者檢出。本次研究也發(fā)現(xiàn)沈陽市胸科醫(yī)院RFP耐藥患者占總耐藥患者的59.41%(120/202)，在RFP耐藥患者中同時耐INH的患者即耐多藥者占90.00%(108/120)，這與以往的研究類似[10]。本研究提示，熒光PCR熔解曲線技術(shù)檢測INH、Am、Lfx敏感度分別為74.84%、 44.00%、 83.33%。這三種藥物在分子藥敏試驗與表型藥敏試驗存在較大差異的原因包括細(xì)菌耐藥產(chǎn)生基因突變的概率不同，如INH耐藥株發(fā)生KatG315位點突變的概率在50%～90%，inhA基因突變的概率在3%～30%[13]，同時有研究報道，inhA基因伴隨katG315同時突變的對INH耐藥呈協(xié)同作用[14]；Lfx耐藥株發(fā)生gyrA基因突變的概率在43%～94%；Am耐藥株的突變位點主要在rrs1401和rrs1484，占到耐藥株的70.5%[15]。本研究熒光PCR熔解曲線技術(shù)對Am耐藥檢測的敏感度僅為44.00%，可能與Am藥敏試驗的穩(wěn)定性較差有關(guān)，同時耐藥與位點突變的相關(guān)性研究仍不完善，導(dǎo)致表型藥敏試驗與分子藥敏試驗的一致性不高。異質(zhì)性耐藥是導(dǎo)致分子藥敏試驗和表型藥敏試驗存在差異的另一個重要原因。MTB的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象普遍，主要是由于同一患者體內(nèi)敏感菌和耐藥菌并存。有研究表明，當(dāng)存在異質(zhì)性耐藥的MTB中耐藥亞群比例高于分子檢測的敏感度時，分子藥敏試驗可判定為耐藥菌；但當(dāng)耐藥菌比例低于分子檢測的敏感度時，分子藥敏試驗無法檢出耐藥菌，會判讀為敏感菌[16]。提高分子檢測對INH、Am和Lfx檢測的敏感度，從而提高分子藥敏試驗與表型藥敏試驗的一致性，仍然是臨床迫切需要的。

綜上，GeneXpert檢測和MGIT 960培養(yǎng)對結(jié)核病的檢測均具有較高的敏感度。熒光PCR熔解曲線技術(shù)對RFP、INH和Lfx的耐藥檢測與比例法藥敏試驗結(jié)果的一致性較高，同時檢測時間可大大縮短。MGIT 960培養(yǎng)對4種藥物的耐藥性檢測效能與比例法藥敏試驗具有極高的一致性，可為MTB鑒定和藥敏試驗提供快速、準(zhǔn)確的報告。