李群 范娟 魏榮榮 葉正琴 丁國偉

摘 ?要：豬感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）14 d后就可以產生針對非結構蛋白（Non-Structural Protein 7，Nsp7）的抗體，而且抗體水平很高，與N蛋白抗體水平相似，但比N蛋白抗體持續(xù)時間更長。另外，檢測Nsp7抗體可用于區(qū)分PRRSV I型和II型的感染。本試驗旨在建立一種快速、特異且敏感的檢測血清中PRRSV抗體的方法。試驗根據NCBI數(shù)據庫錄入的Nsp7蛋白序列（GenBank：EF536003）設計引物，利用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增Nsp7基因，構建原核表達載體pET28a-Nsp7，轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，并誘導重組蛋白表達。利用親和層析純化重組蛋白，Western Blot鑒定表達產物。將純化后的重組蛋白按不同濃度包被酶標板，通過方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度及血清稀釋度，并對其條件進行優(yōu)化，最終建立檢測PRRSV Nsp7抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法。結果表明，試驗表達了重組Nsp7蛋白，重組的Nsp7蛋白能與PRRSV陽性血清發(fā)生特異性反應，建立了一種基于重組Nsp7蛋白的間接ELISA檢測方法。建立的間接ELISA檢測方法分別與商品化PRRSV抗體檢測試劑盒檢測結果相比，兩者符合率為87.74%。試驗表明，建立的間接ELISA方法可以用于PRRSV抗體的檢測。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒;Nsp7基因;原核表達;間接酶聯(lián)免疫吸附測定

中圖分類號：S852.65 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2019）08-0012-07

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，主要表現(xiàn)為患病母豬發(fā)熱、厭食、流產和產死胎、木乃伊胎和弱仔等繁殖障礙以及仔豬嚴重的呼吸道疾病，具有較高的死亡率[1]。由于病死豬呈特征性的耳朵發(fā)紺現(xiàn)象，該病又被稱為豬藍耳病。該病目前存在于我國的大部分省市，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。2006年夏季，我國南方部分省市大規(guī)模暴發(fā)以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的“豬高熱病”，后確診為高致病性豬藍耳病，其病原為PRRSV的變異株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV），與經典的PRRS病毒株相比，以非結構蛋白（Non-Structural Protein 2，Nsp2）中有一個特征性30個氨基酸缺失為特征，具有更強的致病性。后來有研究證明，毒株的毒力增強與Nsp2特征性缺失30個氨基酸無關，目前對其毒力增強的原因尚不清楚[2-3]。病毒變異可能是引起PRRS大規(guī)模暴發(fā)的原因，也給該病的防治帶來了新的挑戰(zhàn)。建立快速可靠的PRRSV抗體檢測方法，監(jiān)測PRRS流行病學以及檢測豬群接種PRRS疫苗后的抗體水平對該病的預防具有重要意義。

PRRSV屬于尼多病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，是一種有囊膜的且不分節(jié)段的正鏈單股RNA病毒。PRRSV基因組長為15.1 kb～15.5 kb，含有9個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），分別編碼PP1a、PP1ab，GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白，其中PP1a經病毒蛋白酶消化分解產生9個非結構蛋白（Nsp1α、Nsp1β、Nsp2～Nsp8），PP1ab經消化分解為4個非結構蛋白（Nsp9～Nsp12）[4]。在上述結構蛋白和非結構蛋白中，N蛋白、GP5蛋白和Nsp7蛋白是檢測抗體的重要靶點[5]。其中，針對Nsp7蛋白的抗體產生較早，豬感染PRRSV 14 d后就可以產生針對Nsp7的抗體，而且抗體水平很高，幾乎可以達到N蛋白和Nsp2的抗體水平，而且比N蛋白抗體持續(xù)時間更長，這表明Nsp7與機體免疫應答關系密切。Nsp7基因在非結構蛋白基因中相對保守，雖然北美型和歐洲型Nsp7氨基酸序列同源性僅有45%，但各型之間的同源性卻很高，歐洲型的同源性在96.7%～97.4%，美洲型的同源性為84.9%～100%，這一特點使得Nsp7蛋白成為檢測抗原、檢測PRRSV抗體水平及區(qū)分不同毒株抗體的首選抗原[6-7]。

本研究擬從PRRSV經典株VR2332株基因組中擴增出編碼Nsp7蛋白基因片段，重組至表達載體pET-28a（+）中，并進行誘導表達、純化與鑒定，以表達的Nsp7蛋白為包被抗原建立間接ELISA檢測方法，為PRRSV抗體檢測試劑盒的研發(fā)和應用奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體

E. coli TOP10、E. coli BL21 （DE3）感受態(tài)細胞和pET-28a載體，均購于Invitrogen公司。pMD19-T載體購于TaKaRa公司。

1.1.2 病毒和血清

JAX1株和豬PRRSV陽性血清由揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司提供。

1.1.3 主要試劑

FastPfu DNA聚合酶、dNTPs、BamH I、Xho I、Trans2K plus DNA marker和Blue plus Protein marker均購自北京全式金生物技術有限公司。質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自美國Axygen公司。Trizol@ Reagent試劑盒均購自天根生化科技有限公司。HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司。HRP標記的鼠抗豬IgG酶標二抗和IPTG均購自Sigma公司。其他試劑為分析純級試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。IDEXX PRRS X3試劑盒購自愛德士。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

根據GenBank中公布的PRRSV VR2332序列（登入號：EF536003），利用oligo7.27設計引物，引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司負責。

Nsp7-up：CGCGGATCCTCTCTGACTGGTGCCC TCGC。

Nsp7-down：CCGCTCGAGTTATTCCCATTGAACTCTTCCATTC。

1.2.2 PRRSV總RNA提取

按照試劑盒說明書提取總RNA。

1.2.3 PRRSV Nsp7基因片段擴增

按照試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板，Nsp7-up和Nsp7-down為引物，進行聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增。反應體系為：1 ?L模板、1 ?L Nsp7-up、1 ?L Nsp7-down、10 ?L緩沖液、4 ?L dNTPs、1 ?L Fastpfu和32 ?L ddH2O。反應條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s和72 ℃ 45 s，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR反應結束后取10 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定片段大小。大小合適的PCR產物按照膠回收試劑盒說明進行膠回收。

1.2.4 PRRSV Nsp7基因片段的克隆與鑒定

將經膠回收的目的片段連接到pMD19-T載體上，轉化E. coli Top10感受態(tài)細胞，獲得重組pMD19-Nsp7。將經菌落PCR鑒定正確的單克隆送金斯瑞公司測序。

1.2.5 原核表達系統(tǒng)的構建與鑒定

將測序正確的重組質粒pMD19-Nsp7用 BamH I和Xho I雙酶切處理。酶切產物電泳，膠回收目的片段，與進行同樣操作的pET-28a進行連接，得到的重組質粒命名為28a-Nsp7。將重組質粒28a-Nsp7轉入E. coli BL21 （DE3）感受態(tài)細胞，挑去陽性克隆進行菌落PCR和酶切鑒定，鑒定正確的重組菌命名為BL21/28a-Nsp7。

1.2.6 BL21/28a-Nsp7的誘導表達

挑取重組菌BL21/28a-Nsp7單菌落接種到LB培養(yǎng)基（含卡那霉素終濃度100 μg/mL）中，37 ℃、220 r/min，培養(yǎng)至光密度（Oplicald Dnsity，OD）600 nm=0.8左右，加入終濃度為 ? 0.4 mmol/L的IPTG進行誘導，誘導過夜，誘導溫度為20 ℃，誘導時轉速為150 r/min。

1.2.7 重組蛋白的純化與鑒定

誘導結束后離心收集菌體，將收集到的菌體用磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）洗滌2次，并用PBS緩沖液重懸菌體。在冰浴條件下超聲波裂解菌體，裂解結束后分別對裂解上清和沉淀取樣，并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）。使用鎳柱對重組蛋白進行純化，純化步驟為：細胞破碎上清在結合緩沖液中過夜透析，透析液上樣過柱（5 mL HisTrap，GE HealthCare），再用結合緩沖液洗滌5個柱體積，最后用洗脫緩沖液洗滌5個柱體積，收集洗脫組分，并用SDS-PAGE蛋白電泳鑒定。

1.2.8 Western Blot鑒定

蛋白樣品跑完SDS-PAGE后，進行轉膜操作，轉膜采用濕轉方式進行，轉膜緩沖液為：三羥甲基氨基甲烷（Tris）3.0 g，甘氨酸（Gly）14.4 g，甲醇200 mL，加去離子水至1 000 mL。轉膜完成后用5%脫脂乳封閉，4 ℃過夜，封閉結束后用PBST洗三遍，加PRRSV陽性血清孵育2 h，孵育結束后用PBST洗5遍，加辣根過氧化酶（HRP）標記的鼠抗豬IgG孵育1 h，孵育結束后用PBST洗5遍，最后加沉淀型四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色10 min～30 min，拍照。

1.2.9 間接ELISA檢測方法的建立

● 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

按照方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將純化抗原做6個包被梯度，分別稀釋至終濃度為 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL和0.312 5 μg/mL，4 ℃過夜包被酶標板。PRRSV陰性和陽性血清按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800和1∶1 600倍稀釋后進行方陣試驗，每個稀釋度2個重復，取其平均值，計算每個條件下陽性血清OD450 nm（P）/陰性血清OD450 nm（N）。選擇陽性血清OD450 nm值接近1.0，P/N值最大的反應組合作為間接ELISA的最佳反應條件。

● 血清最佳作用時間的選擇

加入一抗后，分別在37 ℃作用30 min、60 min和90 min后進行間接ELISA測定。

● 二抗稀釋濃度的選擇

以最適抗原包被濃度、封閉液以及最佳PRRSV陰性和陽性血清稀釋度分步加入反應后，鼠抗豬IgG-HRP分別做1∶5 000、1∶10 000、 ? ?1∶20 000、1∶30 000和1∶40 000稀釋，然后按常規(guī)間接ELISA程序測定。

● 二抗作用時間的選擇

按最佳條件進行包被、封閉和加樣，加入二抗后37 ℃下分別孵育30 min、60 min、 ? ? ?90 min和120 min，通過間接ELISA測定陽性血清的OD450 nm值和陰性血清的OD450 nm值，比較P/N值以選擇最適二抗作用時間。

● 顯色時間的確定

按照已篩選條件進行間接ELISA試驗，最后加入TMB分別顯色5 min、10 min和15 min，測定其陽性血清的OD450 nm值和陰性血清的OD450 nm值。

● ELISA臨界值的確定

用建立的間接ELISA方法檢測43份PRRSV抗體陰性血清，在最佳反應條件下進行間接ELISA試驗。計算平均值（x）和標準差（s），根據統(tǒng)計學原理，以OD450 nm

1.2.10 間接ELISA試劑盒特異性試驗

用建立的間接ELISA方法檢測豬圓環(huán)病毒2型（Porcine CircoVirus Type 2，PCV2）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhoea Virus，PEDV）、豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）、口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）陽性血清，同時設置PRRSV標準陽性和陰性血清對照，驗證該檢測方法的特異性。

1.2.11 比對試驗

取臨床血清767份（來源于全國養(yǎng)殖戶送檢血清），用建立的間接ELISA方法和進口的PRRSV抗體檢測試劑盒同時測定血清樣品，可疑樣品重復檢測一次，若仍為可疑，即判為陽性。比較檢測結果，計算二者符合率。

2 ?結果與分析

2.1 PRRSV Nsp7基因擴增

運用設計的特異性引物擴增PRRSV的Nsp7非結構蛋白基因，擴增得到了一條大小約為777 bp的目的片段（圖1），與理論片段大小一致。

2.2 pMD19-Nsp7的PCR和酶切鑒定

將重組質粒pMD19-Nsp7進行PCR鑒定，可以擴增出大約777 bp大小的特異性片段，經雙酶切鑒定，可以得到與理論大小一致的片段（圖2）。

2.3 PRRSV Nsp7蛋白原核表達系統(tǒng)的構建與鑒定

用菌落PCR初步鑒定陽性克隆，再利用雙酶切對其進行酶切鑒定，結果如圖3。

2.4 Nsp7蛋白的誘導表達與純化

重組菌在20 ℃、0.4 mmol/L IPTG以及150 r/min條件下過夜誘導，離心收集菌體，超聲波裂解菌體，對全菌和破碎上清進行SDS-PAGE鑒定，由圖4可以看出，目的蛋白獲得了較好的可溶性表達。重組蛋白經鎳柱純化后，用SDS-PAGE蛋白電泳鑒定純化后的表達產物，在30 kDa處得到一條單一條帶，與理論大小相符，表明該條帶為PRRSV Nsp7蛋白（圖4）。純化后的蛋白經SDS-PAGE蛋白電泳后轉至NC膜，進行Western Blot鑒定，如圖5所示。

2.5 重組PRRSV Nsp7蛋白間接ELISA檢測方法的建立

2.5.1 最佳抗原包被濃度及最佳血清稀釋度的確定

由方陣滴定結果可知（表1），當重組抗原包被濃度為5 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶200時，陽性血清OD450 nm讀值接近1.0，且P/N值最大。因此，確定最佳抗原包被濃度為5 μg/mL，血清稀釋度為1∶200。

2.5.2 血清最佳作用時間的確定

表2結果顯示，當血清作用30 min時，P/N值最大。因此，血清最佳作用時間為30 min。

2.5.3 最佳二抗稀釋度和二抗作用時間的確定

按照2.5.1和2.5.2試驗結果進行間接ELISA操作，試驗結果見表3和表4，二抗以1∶10 000稀釋，37 ℃作用60 min時OD450 nm最為適宜，P/N值最大，因此二抗的最佳作用濃度為1∶10 000，最佳作用時間是60 min。

2.5.4 最適底物作用時間的確定

抗原、血清和酶標抗體按照以上最適工作條件進行，加入底物后，于37 ℃分別作用 ? ?5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，終止反應，測定OD450 nm值。測定結果（表5）顯示，在37 ℃下作用10 min可以作為顯色時間的最佳條件。

2.5.5 臨界值的確定

選取43份陰性血清，按照上述建立的間接ELISA檢測方法進行檢測，將測得的OD450 nm進行處理，平均值為0.353，標準差為0.022，x+2s=0.397，x+3s=0.419。因此，OD450 nm< 0.397判為陰性，OD450 nm≥0.419判為陽性，0.397≤OD450 nm<0.419為可疑。

2.5.6 與IDEXX試劑盒比較試驗結果

選取IDEXX試劑盒檢測過的血清樣品，總計767份，使用上述試驗建立的間接ELISA檢測方法對這些樣品進行檢測。試驗結果與IDEXX產品對比顯示，IDEXX試劑盒檢測樣品的陽性率為92.4%，陰性率為7.5%;上述試驗建立的方法檢測樣品的陽性率為94.7%，陰性為5.2%;兩者符合率為87.74%。

2.5.7 特異交叉反應試驗結果

利用重組Nsp7蛋白建立的間接ELISA檢測方法檢測PCV2、PRV、CSFV、FMDV、TGEV和PEDV陽性血清，結果均為陰性，PRRSV陰陽性血清對照均成立（表6）。結果說明建立的間接ELISA檢測方法具有較高的特異性。

3 ?討論

用于PRRSV檢測的ELISA試劑盒包被用抗原主要有純化的PRRSV全病毒和重組N蛋白兩種[8]。由于全病毒抗原純化工藝復雜，有些細胞培養(yǎng)成分不易純化干凈，容易引起較強的非特異性反應或背景反應，而且會有潛在的散毒危險，故當前很少使用[9]。ORF7編碼的N蛋白是PRRSV主要的結構蛋白之一，也是PRRSV病毒粒子中含量最多的病毒蛋白。PRRSV感染豬體后，首先誘導產生抗N蛋白的抗體。1977年Denal等首先報道了用桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得重組N蛋白，建立了重組N蛋白間接ELISA方法[10]。Dea S等用大腸桿菌表達的重組N蛋白建立了競爭ELISA方法[11]。近年有研究人員利用GP5-AB蛋白、重組Nsp7蛋白和重組Nsp2蛋白建立檢測PRRSV的ELISA方法，敏感性和特異性也較高[12]。

本研究使用重組Nsp7蛋白作為包被抗原建立ELISA方法，這是由于在PRRSV感染中，Nsp7抗體產生較早，豬體感染PRRSV 14 d后就可以產生針對Nsp7的抗體，免疫原性較高，抗體水平幾乎可以達到N蛋白和Nsp2的抗體水平，而且比N蛋白持續(xù)時間更長。

本研究的重組Nsp7蛋白以可溶形式存在，具有正確的高級結構，可以增加檢測的特異性和敏感性。再通過優(yōu)化各種檢測條件，建立了特異性、重復性和靈敏度較好的間接ELISA方法，從而進行PRRSV的阻斷及疫苗免疫效果評價。通過與IDEXX生產的PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒平行檢測767份臨床血清樣本對比發(fā)現(xiàn)，本研究建立的ELISA方法檢測結果與商品化試劑盒符合率為87.74%。造成這一現(xiàn)象的原因可能是兩種試劑盒所用包被抗原不同，商品化試劑盒采用重組N蛋白作為抗原，而本研究采用重組Nsp7蛋白作為抗原。PRRSV N蛋白有一定的變異性，本研究選取具有保守性的基因（Nsp7）進行原核表達，以此建立間接ELISA檢測方法，可增加對變異株產生抗體的檢出率，增加檢測方法的敏感性和特異性，減少假陰性的出現(xiàn)。

綜合上述結論，本研究建立的基于PRRSV Nsp7蛋白的間接ELISA方法，具有良好的重復性和特異性，并可能在臨床上成為檢測豬群中PRRSV抗體水平及檢測PRRS流行情況的有效方法。□□

參考文獻：（12篇，略）