沈麗琴，楊 晗，李勝華，高 羽，徐 翔，胡浩武，周青罡

(江西匯仁藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330052)

回顧歷代本草文獻(xiàn)，熟地黃炮制方法各異，有蒸法、酒煮法、酒燉法、姜制法、砂仁制法及制炭等，但是蒸法始終是各個(gè)時(shí)期地黃炮制的主流，蒸法有單蒸、加酒蒸和“九蒸九曬”[1]，其中單蒸被《中國(guó)藥典》2015年版定為法定方法，這種方法的關(guān)鍵在于對(duì)蒸制溫度和蒸制時(shí)間的控制。但歷版《中國(guó)藥典》以及各省市地方炮制規(guī)范中關(guān)于熟地黃的蒸制工藝均無明確工藝參數(shù)，且炮制程度的判斷主要靠手摸、目測(cè)、品嘗等感官分析，要求“黑潤(rùn)，斷面烏黑色，有光澤，味甜”，這種寬范圍的感官標(biāo)準(zhǔn)主觀性較強(qiáng)，判斷結(jié)果因人而異，容易導(dǎo)致熟地黃的質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響臨床療效[2]，因此亟待建立一個(gè)熟地黃炮制終點(diǎn)的量化判定標(biāo)準(zhǔn)。而對(duì)于熟地黃的炮制，須判斷采用哪種蒸制工藝效果最佳。眾所周知，“九蒸九曬”是不少本草古籍記載的熟地黃傳統(tǒng)炮制方法，很多老藥工也提倡要“九蒸九曬”。一般認(rèn)為，“九蒸九曬”熟地黃，其性滋而不凝，補(bǔ)而不膩，療效遠(yuǎn)勝過一般熟地黃。但是“九蒸九曬”有工藝繁瑣、消耗燃料多、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。目前有關(guān)熟地黃炮制研究的報(bào)道較多[3-7]，但對(duì)傳統(tǒng)“九蒸九曬”炮制工藝和現(xiàn)代大生產(chǎn)常壓一次蒸制工藝的比較研究還較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷A、5-羥甲基糠醛(5-HMF)和葡萄糖等熟地黃中代表性成分的含量為指標(biāo)，對(duì)傳統(tǒng)“九蒸九曬”法與現(xiàn)代常壓一次蒸制法炮制過程中的成分變化規(guī)律進(jìn)行研究，并比較兩者差異，為以傳統(tǒng)“九蒸九曬”熟地黃為參照來優(yōu)選熟地黃現(xiàn)代炮制工藝研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀；AG135型十萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；AB204-S型萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；DC200H超聲波清洗機(jī)(三角洲超音波有限公司)。

1.2 材料

本研究所用生地黃產(chǎn)地為河南，經(jīng)鑒定為玄參科地黃屬植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的塊根；對(duì)照品梓醇(批號(hào)：110808-201711)、毛蕊花糖苷(批號(hào)：11530-201713)、5-羥甲基糠醛(批號(hào)：111626-201711)和D-無水葡萄糖(批號(hào)：110833-201707)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；地黃苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：D083-170728)。甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 熟地黃炮制品制備

2.1.1 常壓一次蒸制熟地黃 取生地黃，洗凈，分別蒸制2、4、6、8、12、16 h。稍晾干，拌回蒸液。置干燥箱內(nèi)，80 ℃干燥，干燥至八成干不粘刀為準(zhǔn)。干燥后的熟地黃進(jìn)行切制，切藥長(zhǎng)度為15 mm。切制好的熟地黃最后進(jìn)行第2次干燥，干燥條件同上。分別留樣分析。

2.1.2 九蒸九曬熟地黃 取生地黃，洗凈，蒸制3 h，再燜制1 h。稍晾干，拌回蒸液。置干燥箱內(nèi)，80 ℃干燥，干燥至八成干不粘刀為準(zhǔn)。干燥后的熟地黃進(jìn)行切制，切藥長(zhǎng)度為15 mm。切制好的熟地黃最后進(jìn)行第2次干燥，干燥條件同上，即得一蒸一曬熟地黃，反復(fù)蒸制9次，每次留樣分析。

2.2 梓醇、毛蕊花糖苷的含量測(cè)定

梓醇的含量測(cè)定方法參照2015版《中國(guó)藥典》“地黃含量測(cè)定”項(xiàng)下梓醇的測(cè)定方法[8]。毛蕊花糖苷的含量測(cè)定方法參照2015版《中國(guó)藥典》“熟地黃含量測(cè)定”項(xiàng)下毛蕊花糖苷的測(cè)定方法[8]，結(jié)果見表1和表2。

2.3 地黃苷A的含量測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道所用的方法[9]。供試品溶液的制備：取各批次熟地黃樣品粉碎過20目篩，取0.5 g置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，置于室溫下冷浸過夜后超聲提取1.5 h，冷卻至室溫，補(bǔ)足減少的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)?5%甲醇溶解，定容至5 mL。用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的地黃苷A對(duì)照品12.0 mg，加甲醇定容至20 mL，制成含地黃苷A 600 μg/mL的對(duì)照品溶液。

色譜條件：色譜柱為安捷倫Zorbax Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，體積流量為1 mL/min，柱溫為25 ℃。流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水(3∶97)，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

線性關(guān)系考察：將對(duì)照品分別配成地黃苷A質(zhì)量濃度12、24、60、120和600 μg/mL的溶液。按上述色譜條件各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。將所得峰面積積分值與各對(duì)照品的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)及線性范圍分別為：y=3.694 3x-9.988 1，r=0.999 9。

樣品定量測(cè)定：取各供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1和表2。

2.4 5-羥甲基糠醛的含量測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道所用的方法[9]。供試品溶液的制備：制法同測(cè)定地黃苷A的方法。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，加甲醇定容至10 mL。制成含5-羥甲基糠醛1 001.95 μg/mL的對(duì)照品溶液。

色譜條件：色譜柱為ZORBAX Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，體積流量為1 mL/min，柱溫為25 ℃。流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(11∶89)，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm。

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品溶液分別配成質(zhì)量濃度為0.40、1.00、10.02、40.08和201.60 μg/mL的溶液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，將峰面積與5-HMF質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=86.414x+85.009，r=0.999 8。

樣品定量測(cè)定：取各供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1和表2。

2.5 葡萄糖的含量測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道所用的方法[9]。供試品溶液的制備：取各批次熟地黃樣品各1 g，置錐形瓶中，加入20 mL蒸餾水，超聲提取2 h，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，置于離心管中離心，傾出上清液，置于PE管中待用。量取待用液1 mL定容至10 mL。用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

對(duì)照品溶液制備：精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的無水葡萄糖對(duì)照品適量，加1%乙腈水定容至5 mL。制成含無水葡萄糖1.466 63 mg/mL的對(duì)照品溶液。

色譜條件：色譜柱為Accurasil NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(72∶28)體積流量1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)器為ELSD，Alltech2000ES，漂移管溫度93 ℃，氣體體積流量2.6 L/min。色譜圖見圖6。

線性關(guān)系考察：參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道所用的方法[9]。取對(duì)照品溶液，分別配成葡萄糖質(zhì)量濃度為0.07、0.15、0.29、0.44和1.47 mg/mL的溶液。各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，將峰面積的對(duì)數(shù)與質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=1 722.1x-45.327，r=0.999 6。

樣品定量測(cè)定：取各供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1和表2。

表1 熟地黃常壓一次蒸制工藝樣品成分測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

注：扣除水分。

表2 熟地黃“九蒸九曬”工藝樣品成分測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

注：扣除水分。

2.6 結(jié)果分析

圖1 梓醇液相色譜(對(duì)照品、生地黃、熟地黃)

圖2 地黃苷A液相色譜(對(duì)照品、生地黃、熟地黃)

圖3 毛蕊花糖苷液相色譜(對(duì)照品、生地黃、熟地黃)

圖4 毛蕊花糖苷液相色譜(對(duì)照品、生地黃、熟地黃)

圖5 葡萄糖液相色譜(對(duì)照品、生地黃、熟地黃)

在常壓一次蒸制過程中，隨蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)，梓醇的含量下降極其明顯，與生品相比，蒸制2 h時(shí)其含量約降低60%；在2～4 h，含量略有升高；4 h之后，含量又緩慢下降，到16 h時(shí)其含量較生品約降低74%。地黃苷A的含量在加熱蒸制2 h前，有一定的下降，2 h后含量變化不大，經(jīng)炮制后下降幅度為20%～38%。毛蕊花糖苷的含量經(jīng)加熱蒸制后，在2 h時(shí)較生品含量有一個(gè)急劇的下降，下降幅度約為80%；在2～4 h時(shí)，含量下降幅度降低；4 h以后隨蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量變化不大，趨于穩(wěn)定，最終下降幅度約為85%；在蒸制16 h后，其含量測(cè)定也能達(dá)到2015版藥典對(duì)熟地黃毛蕊花糖苷含量的要求(不能低于0.2 mg/kg)。糖熱降解產(chǎn)物5-HMF在蒸制過程中表現(xiàn)為隨蒸制時(shí)間增加含量也相應(yīng)增加，6 h之前，含量升高幅度不大；之后升高幅度逐漸增加，12 h含量最高；到16 h時(shí)，含量略有下降，可能是由于5-HMF 的分解和蒸制過程中的水氣蒸發(fā)也會(huì)帶走少量的5-HMF。而葡萄糖在加熱炮制過程中，其含量逐漸升高，到16 h后，增加3.5倍，之后還有再增加的趨勢(shì)。

在“九蒸九曬”不同蒸曬次數(shù)時(shí)，梓醇的含量隨著蒸曬次數(shù)的增加而逐漸減小，到第8次蒸曬含量變化趨于穩(wěn)定，第9次蒸曬其含量極低，較生品下降約97%。地黃苷A的含量變化趨勢(shì)與梓醇類似，第9次蒸曬時(shí)較生品下降約72%。毛蕊花糖苷的含量也是隨著蒸曬次數(shù)的增加而逐漸減小，不過到第4次蒸曬之后，含量降低的幅度趨緩，第9次蒸曬時(shí)含量較生品下降約92%。5-HMF的含量隨著蒸曬次數(shù)的增加而逐漸增加，其中第1～6次蒸曬過程中，含量明顯增加，到第7次趨于平穩(wěn)，第9次其含量達(dá)到了2.76 mg/g。葡萄糖的含量隨蒸曬次數(shù)的增加而略有增加，到第3次時(shí)含量最高，增加幅度較生品高約2.1倍，隨后含量略有下降，第9次蒸曬含量較生品增加約1.5倍。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)制備的“九蒸九曬”熟地黃，通過各成分含量測(cè)定結(jié)果可以看出，經(jīng)九制后梓醇、地黃苷A和毛蕊花糖苷的含量，分別較生品下降約97%、72%和92%；5-HMF經(jīng)九制后含量達(dá)到2.76 mg/g；葡萄糖較生品增加了約1.5倍。而常壓一次蒸制16 h后，熟地黃中梓醇、地黃苷A、毛蕊花糖苷的含量分別較生品下降約74%、28%、86%，5-HMF含量為0.27 mg/g。兩者相比，常壓一次蒸制16h熟地黃與“九蒸九曬”熟地黃在主要成分含量上還是有很大差異，說明現(xiàn)代常壓一次蒸制工藝很難達(dá)到“九蒸九曬”工藝的炮制程度。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為“九蒸九曬”熟地黃療效比較好，但“九蒸九曬”工藝不適合工業(yè)化生產(chǎn)，而現(xiàn)代企業(yè)在中藥炮制中，已經(jīng)越來越多的采用高壓蒸制法，因?yàn)楦邏赫糁品ㄓ忻黠@縮短炮制時(shí)間、提高生產(chǎn)效率和節(jié)約生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)。前期我們?cè)趯?duì)不同干燥溫度的熟地黃樣品的研究中，發(fā)現(xiàn)隨著干燥溫度的增加，熟地黃中各成分含量的變化速度會(huì)加快(尤其是梓醇和5-HMF)。而在高壓蒸制時(shí)蒸制溫度通常可達(dá)到130 ℃以上，在如此高的溫度下可以加快成分之間的變化，也就是通過短時(shí)間的高壓蒸制也可達(dá)到“九蒸九曬”的炮制程度。后續(xù)我們將以“九蒸九曬”熟地黃為參照標(biāo)準(zhǔn)，在大規(guī)模生產(chǎn)的情況下進(jìn)行高壓蒸制工藝的研究。

5-HMF是很多中藥及其炮制品中存在的一種成分，其對(duì)光、溫度和空氣敏感，當(dāng)在高溫條件下時(shí)，藥材中的葡萄糖、果糖等單糖化合物發(fā)生麥拉德反應(yīng)，脫水生成了5-HMF[10]，有研究表明加熱時(shí)間和溫度是影響5-HMF的首要因素[11]。通過對(duì)常壓一次蒸制和“九蒸九曬”的工藝研究，我們發(fā)現(xiàn)隨著炮制程度的加深，5-HMF的含量也在逐漸增加，其量的增加與炮制程度密切相關(guān)，因此可以考慮將5-HMF作為一個(gè)評(píng)價(jià)熟地黃炮制程度的輔助質(zhì)量指標(biāo)。