王藝琛，高輝，張昌軍，刁紅錄

(1.十堰市人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院)生殖醫(yī)學(xué)中心，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院，十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000)

哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜而精確，任何一個(gè)環(huán)節(jié)都不容忽視。組蛋白翻譯后修飾在其中有著必不可少的作用。蛋白質(zhì)精氨酸甲基化是表觀遺傳水平重要的修飾方式之一，它參與了配子發(fā)生、性激素調(diào)控、胚胎發(fā)育以及生殖系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展等活動(dòng)。本文對(duì)精氨酸甲基化修飾活動(dòng)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的總結(jié)，旨在對(duì)研究者們提供一定參考。

一、PRMTs概述

翻譯后修飾(PTM)是表觀遺傳學(xué)中的核心部分，而組蛋白甲基化在其中有著重要的作用，其中決定組蛋白甲基化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Protein arginine methyltransferases，PRMTs)已被證明在人體的各個(gè)組織中廣泛分布。PRMTs在前體RNA的剪切、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA的修復(fù)、mRNA的翻譯以及細(xì)胞分化過程中有重要作用[1]。PRMTs作為一類甲基化酶，它可以催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyme-thionine，SAM)上的甲基轉(zhuǎn)移到精氨酸的胍基上，并產(chǎn)生甲基精氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸。已有研究證明，哺乳動(dòng)物體內(nèi)有三種PRMTs存在，分別為Type Ⅰ(PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT4/CARM1、PRMT6 和 PRMT8)，Type Ⅱ(PRMT5 和 PRMT9)以及Type Ⅲ(PRMT7)[2]。Ⅰ型和Ⅱ型可以分別催化中間產(chǎn)物MMA生成非對(duì)稱二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine，aDMA)和對(duì)稱二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine，sDMA)，而Ⅲ型只能催化組蛋白生成單甲基精氨酸(Monomethylarginine，MMA)(圖1)[1]。MMA，aDMA與sDMA是哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的三種主要甲基精氨酸形式[1，3]。

圖1 蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶作用底物及產(chǎn)物[1]

目前已知PRMTs可以甲基化的具有研究意義的位點(diǎn)有H3R2、H3R8、H3R17、H3R26和H4R3，這些位點(diǎn)具有激活或抑制染色質(zhì)功能的作用[2]。PRMTs家族中所有成員都含有大約310個(gè)保守的氨基酸核心催化區(qū)域，有一些成員還含有特殊的結(jié)構(gòu)，如含有SH3結(jié)構(gòu)的PRMT2，含有鋅指結(jié)構(gòu)的PRMT3，含有TIM barrel結(jié)構(gòu)的PRMT5以及含有重復(fù)TPR結(jié)構(gòu)的PRMT9。值得一提的是，PRMT7和PRMT9都含有兩個(gè)重復(fù)且連續(xù)的甲基轉(zhuǎn)移酶片段，而其它成員只有一個(gè)催化中心，這可能是因?yàn)榛蜃灾鲝?fù)制的原因[3]。Tudor結(jié)構(gòu)域是一個(gè)保守的含有50個(gè)氨基酸的多肽，甲基化后的精氨酸與其結(jié)合的能力增強(qiáng)了，目前已知的主要可以被甲基化的含有Tudor結(jié)構(gòu)域的多肽有活性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(Survival of motor neuron，SMN)，剪切因子(Splicing factor 30，SPF30)以及Tudor domain-containg protein1/2/3/6/9/11(TDRD1/2/3/6/9/11)[4]。

二、PRMTs在生殖中的功能

1.PRMTs與配子發(fā)生：配子形成的過程稱為配子發(fā)生。配子包括雄配子和雌配子，雌、雄配子的發(fā)生都要經(jīng)過三個(gè)時(shí)期，即增殖期、生長(zhǎng)期和減數(shù)分裂期。原始生殖細(xì)胞(Primordial Germ Cell，PGC)是指產(chǎn)生雄性和雌性生殖細(xì)胞的早期細(xì)胞。PRMT5與生殖細(xì)胞決定基因(PR domain zinc finger protein 1，PRDM1)共同促進(jìn)PGC的發(fā)生發(fā)育，通過促進(jìn)Sm剪接體蛋白(a family of RNA-binding proteins)的甲基化并顯著改變PGC的RNA剪接譜來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。小鼠胚胎發(fā)育到第8.5天時(shí)，PRMT5在細(xì)胞中的表達(dá)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，能夠?qū)е赂咚降腍4R3me2修飾。在精、卵結(jié)合后10.5 d，PRMT5通過抑制PGC的轉(zhuǎn)座因子和調(diào)控RNA的正確剪切來應(yīng)對(duì)DNA損傷，從而起到保護(hù)基因組完整性的作用，這兩種依賴于PRMT5的保護(hù)機(jī)制能維持PGC的正常發(fā)生[5]。而在E11.5，PRMT5-BLIMP1復(fù)合物易位回到細(xì)胞質(zhì)，隨后H4R3me2修飾減少，此時(shí)DNA甲基化在PGC中達(dá)到基礎(chǔ)水平。H4R3me2是一種抑制性組蛋白修飾，其中包括RNA剪接和p53所必需的神經(jīng)祖細(xì)胞中的Sm蛋白。PRMT5催化的H2A/H4R3me2s修飾在早期PGC的LINE1長(zhǎng)分散核元件1(Long interspersed nuclear element 1，LINE1)和凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)轉(zhuǎn)座子上大量發(fā)生，PRMT5的失活會(huì)導(dǎo)致這種修飾減少，PGCs的凋亡，以及雄性和雌性不育[6]。精子的成熟要經(jīng)歷精原細(xì)胞、初級(jí)次級(jí)精母細(xì)胞以及精子細(xì)胞階段，精氨酸甲基化在其中也扮演著重要的角色。 PRMT5主要在雄性小鼠睪丸的精母細(xì)胞中大量表達(dá)，而不是精子發(fā)生過程中的其他階段。PRMT5敲除后，小鼠的初級(jí)精母、初級(jí)卵母細(xì)胞不能正常的進(jìn)行減數(shù)分裂，二甲基化H4R3變少，而且其增殖也會(huì)變得異常。這說明PRMT5在生殖細(xì)胞發(fā)育中的功能可能是由H4R3me2介導(dǎo)的[7-8]。PRTM4在小鼠睪丸中高度表達(dá)。在精子發(fā)生過程中，PRMT4首先表達(dá)在精母細(xì)胞的胞質(zhì)，而后表達(dá)在精子細(xì)胞的細(xì)胞核，這表明PRTM4主要在精子發(fā)生后期具有重要作用[9]。PRMT6作為剪切和修復(fù)DNA堿基的調(diào)節(jié)因子，可通過與DNA聚合酶形成復(fù)合物來刺激DNA聚合酶的活性。DNA堿基的切除修復(fù)在初級(jí)精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的發(fā)生過程中有著重要作用，而DNA聚合酶也被發(fā)現(xiàn)在減數(shù)分裂中參與染色體結(jié)合和重組過程。表明PRMT6可通過調(diào)節(jié)DNA聚合酶在減數(shù)分裂和重組中發(fā)揮作用從而影響精子的發(fā)生[10]。

2.PRMTs與受精：受精是卵母細(xì)胞和精子融合為一個(gè)合子的過程，受精過程包括卵母細(xì)胞激活、精子獲能和兩性原核融合三個(gè)主要階段。當(dāng)精子進(jìn)入卵母細(xì)胞時(shí)，它必須經(jīng)歷依賴于母體因素以進(jìn)行生化重塑。

精子頭部的去致密化是由母核纖溶酶2(Nucleoplasmin 2，NPM2)進(jìn)行的，它將魚精蛋白釋放到卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，為雄原核(pronuclei，PN)的形成做好準(zhǔn)備。原核新核小體的組裝依賴于母體組蛋白H3.3及其伴侶蛋白Hira(Histone cell cycle regulator，Hira)，這對(duì)于PN的形成至關(guān)重要。缺乏非對(duì)稱二甲基化組蛋白H3R17me2a的H3.3不能參與PN的形成，說明Ⅰ型PRMTs對(duì)稱二甲基化H3R17me2a修飾在受精早期可能起著重要的作用[11]。

3.PRMTs與早期胚胎發(fā)育：早期胚胎正常發(fā)育是維持妊娠的重要環(huán)節(jié)，包括受精后早期的細(xì)胞分裂，桑葚胚、囊胚的形成及胚泡植入子宮內(nèi)膜等過程。任何影響早期胚胎發(fā)育的因素都可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育缺陷。

胚胎干細(xì)胞對(duì)胚胎各個(gè)系統(tǒng)的正常發(fā)育是至關(guān)重要的。PRMT1能夠甲基化富含甘氨酸-精氨酸的結(jié)構(gòu)域，抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中PRMT1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致此類型結(jié)構(gòu)域的低甲基化(如Sam68和MRE11等)，致使自發(fā)性DNA損傷，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞周期進(jìn)程延遲，染色體非整倍性和多倍體的出現(xiàn)，最終胚胎在E6.5死亡[12]。抑制PRMT1在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)性震顫并且在出生后兩周內(nèi)死亡。PRMT1缺陷小鼠神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞大量減少，說明PRMT1可能對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟起著重要作用[13]。PRMT1小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除小鼠在出生后15 d內(nèi)死亡，主要原因是胚胎表面顳動(dòng)脈血液灌注不良，3D成像顯示血管分段且擴(kuò)張成空腔[14]。PRMT3的缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎在妊娠期間發(fā)育遲緩，主要原因是小鼠成纖維細(xì)胞胞質(zhì)中核糖體蛋白rpS2(40S ribosomal protein S2，rpS2)的低甲基化[15]。PRMT4敲除小鼠在出生后不久死亡，可能是其胸腺細(xì)胞的發(fā)育停留在祖細(xì)胞階段，而脂肪細(xì)胞的生成也有障礙，其體型較野生型小。PRMT4/ CARM1在早期神經(jīng)元發(fā)育中也有重要作用，Sox1和NF1分別是參與維持早期神經(jīng)元祖細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞系平衡的基因，CARM1可以通過甲基化H3R17來調(diào)節(jié)Sox1和NF1的轉(zhuǎn)錄。此甲基化過程在發(fā)育后期對(duì)膠質(zhì)譜系特異的miRNA啟動(dòng)子如miR10a、miR575和miR92a發(fā)揮進(jìn)一步的調(diào)節(jié)作用[16]。CARM1可以調(diào)節(jié)卵裂球中組蛋白H3R17和H3R26的甲基化水平，這兩種組蛋白的甲基化會(huì)促進(jìn)小鼠植入前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)生，這是表觀遺傳控制胚胎干細(xì)胞多能性所必需的[17]。在神經(jīng)干細(xì)胞中選擇性敲除PRMT5 同樣會(huì)導(dǎo)致小鼠在出生后不久死亡，主要原因是PRMT5的缺失會(huì)導(dǎo)致Sm蛋白甲基化水平下降并且Mdm4(p53 regulator)前體RNA的合成異常會(huì)激活p53信號(hào)通路，從而引起細(xì)胞程序性死亡[18]。PRMT6敲除小鼠可以正常存活，但分離出來的胚胎成纖維細(xì)胞在體外卻發(fā)生早衰，這可能是因?yàn)镻RMT6缺失致使胚胎成纖維細(xì)胞在體外細(xì)胞周期停留在G0/G1期[19]。PRMT8是一種特異性表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的精氨酸甲基化修飾酶。它的缺失會(huì)擾亂了軸突或樹突在發(fā)育中所需蛋白質(zhì)的合成，這對(duì)視覺皮質(zhì)回路的形成造成了不利影響從而使視覺下降或消失[20]。

圍著床期信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精確，分子動(dòng)態(tài)變化復(fù)雜，精氨酸甲基化活動(dòng)也參與在其中。缺乏PRMT4胚胎細(xì)胞雌激素受體蛋白和NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)信號(hào)傳導(dǎo)途徑存在缺陷，并且雌激素應(yīng)答的消除和一些ERα靶基因的表達(dá)也減少[21]。 受精卵中的PRMT5是母系遺傳的，且PRMT5蛋白的表達(dá)在4到8細(xì)胞期之間被激活。在原始生殖細(xì)胞中，PRMT5蛋白在胚胎發(fā)育的4細(xì)胞階段以及E8.5從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中。在胚胎植入后，PRMT5蛋白重新從細(xì)胞核轉(zhuǎn)出至細(xì)胞質(zhì)，主要在外胚層細(xì)胞中表達(dá)。這時(shí)的外胚層細(xì)胞屬于相對(duì)休眠狀態(tài)的滋養(yǎng)外胚層，PRMT5則啟動(dòng)DNA甲基化和RNA剪切活動(dòng)[6， 22]。PRMT5在著床前后由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并介導(dǎo)組蛋白甲基化活動(dòng)，說明它在著床過程中可能起到了一定的作用。PRMT5敲除小鼠在E6.5停止發(fā)育，這可能是由于其囊胚期多能干細(xì)胞多能性的喪失而導(dǎo)致。進(jìn)一步研究表明在PRMT5缺陷胚胎生殖細(xì)胞中H4R3me2s顯著降低，而H3R2me2s的水平不變說明PRMT5可能通過調(diào)節(jié)H4R3me2s水平調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞發(fā)育[23]。

敲除模型是研究早期胚胎發(fā)育的一個(gè)重要技術(shù)，PRMTs家族成員的敲除模型證明PRMTs無論是對(duì)組蛋白修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)還是細(xì)胞周期都是必不可少的。因此，深入研究PRMTs影響發(fā)育的機(jī)制對(duì)生殖領(lǐng)域具有重要意義。

4.PRMTs與性激素受體：性激素調(diào)控在哺乳動(dòng)物生殖中有著重要作用。性激素受體包括雄激素受體(AR)、雌激素受體(ESR)和孕激素受體(PGR)，性激素是經(jīng)其受體通過上下級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)而發(fā)揮生物學(xué)作用，所以性激素受體的正常表達(dá)對(duì)生殖系統(tǒng)中存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有著重要的作用。雌激素的生物學(xué)作用是通過受體ESRα和ESRβ介導(dǎo)的，ESRα和ESRβ在細(xì)胞核中起著配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子的作用。ESRα的甲基化是動(dòng)態(tài)的和周期性的，在雌二醇(E2)處理過的細(xì)胞中，PRMT1可以瞬時(shí)甲基化ESRα內(nèi)的精氨酸260(R260)DNA結(jié)合域。雌二醇可以通過控制ESRα，酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)和PI-3激酶的p85亞基(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)的復(fù)合物來快速激活雌激素受體細(xì)胞質(zhì)途徑，傳導(dǎo)信號(hào)至下游使激酶MAPK和AKT活化來協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖和存活。被甲基化后的ESRα可用于控制雌激素的快速生理反應(yīng)，誘導(dǎo)復(fù)合物的解離并最終導(dǎo)致下游激酶活性的消失[24]。PRMT1的結(jié)合蛋白FOP在激活雌激素受體靶基因(Trefoil factor 1，TFF1)中起重要作用，F(xiàn)OP的敲除會(huì)導(dǎo)致雌激素受體的啟動(dòng)子被阻斷。因此猜測(cè)FOP募集到啟動(dòng)子是激活雌二醇依賴性轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵蛋白[25]。PRMT2可增強(qiáng)雌激素受體ESRα、雄激素受體AR、孕激素受體PGR 、視黃酸核受體(retinoic acid receptor alpha，RARα)、過氧化物酶增殖激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的轉(zhuǎn)錄活性[26]。外源性雌激素也可以阻斷PRMTs的甲基化活動(dòng)，如他莫昔芬(Tamoxifen，Tam)可以抑制CARM1作為共激活因子的作用從而抑制雌激素受體的的活化[24， 27]。此外，雌激素ESRα受體的共激活因子的募集是有序的，ESR招募類固醇受體輔助激活因子3(steroid receptor coactivator-3，SRC-3)，和共激活因子p300/CBP與CARM1。CARM1的招募滯后于SRC-3和p300。CARM1的募集改變了已有的ERE/ESRα/SRC-3/p300復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組織。它誘導(dǎo)p300發(fā)生構(gòu)象變化，增加其對(duì)組蛋白H3K18殘基上p300的乙?；?，從而使H3R17殘基甲基化以增強(qiáng)自身的轉(zhuǎn)錄活性[9， 28]。

AR是核受體(Nuclear receptor，NR)超家族的成員，在配體結(jié)合后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核并與DNA應(yīng)答元件相互作用以調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。PRMT2的兩末端在與AR結(jié)合的過程中分工不同，C末端負(fù)責(zé)與AR結(jié)合，而N-末端則負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的共激活[29]。AR的轉(zhuǎn)錄激活需要PRMT6的催化活性和AKT結(jié)構(gòu)域精氨酸殘基的甲基化參與。而PRMT6可以促進(jìn)前列腺癌特異性抗原PSA(Prostate-specific antigen，PSA)和KLK2(kallikrein-2，KLK2)的轉(zhuǎn)錄，提示PRMT6可能通過調(diào)控AR下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[30]。

5.PRMTs與不孕相關(guān)疾?。憾嗄衣殉簿C合征(PCOS)是生育期女性常見的女性內(nèi)分泌紊亂和糖脂代謝異常的全身性疾病，是女性不孕主要原因之一。最近的一項(xiàng)研究表明，PCOS婦女血液循環(huán)中的aDMA濃度明顯高于對(duì)照組，但提高血清雌、孕激素可以降低aDMA的濃度，并且可以降低胰島素抵抗[31-32]。aDMA作為一氧化氮合酶(NO synthase，NOS)的內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可抑制NO 的合成，使NO/NOS 通路發(fā)生障礙、NO 合成減少。PRMT1、PRMT2和PRMT4的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致aDMA的合成大量增加，aDMA的積累會(huì)影響NOS和NO的合成，而過低的NO濃度會(huì)提高PCOS發(fā)生的機(jī)率[33]。

子宮內(nèi)膜異位癥是指有活性的內(nèi)膜細(xì)胞種植在子宮內(nèi)膜以外的位置而形成的一種女性常見婦科疾病，它是一種慢性疾病，異位的內(nèi)膜造成不育和慢性疼痛。免疫組織化學(xué)證實(shí)CARM1蛋白在子宮內(nèi)膜和卵巢中的表達(dá)下調(diào)，并根據(jù)月經(jīng)周期表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)表達(dá)模式，在增生晚期和分泌中期表達(dá)較高，在分泌晚期表達(dá)較少[34]。在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生15個(gè)月后，卵巢中PRMT1、PRMT2和PRMT8以及CARM1蛋白顯著降低，提示精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致良性和癌前疾病的發(fā)生，如細(xì)胞增殖減弱、異常細(xì)胞克隆和基因組不穩(wěn)定等變化。而且，顆粒細(xì)胞和排卵前卵母細(xì)胞中CARM1的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平也顯著降低[35]。

三、展望

雖然人們對(duì)精氨酸甲基化酶的結(jié)構(gòu)和生化特性有了較深入的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)這些酶的生物學(xué)功能和其參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還知之甚少，尤其是動(dòng)物中精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能以及其調(diào)控的生物學(xué)過程的分子機(jī)理還不清楚?；虻墓δ芎蜕飳W(xué)過程的進(jìn)行是由染色質(zhì)的狀態(tài)決定的，組蛋白翻譯后修飾在調(diào)節(jié)真核生物染色質(zhì)的功能狀態(tài)中起關(guān)鍵的作用。已有的結(jié)果證明精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶可以甲基化組蛋白精氨酸位點(diǎn)。因此，對(duì)參與催化組蛋白翻譯后修飾和隨后的細(xì)胞表觀遺傳狀態(tài)的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的功能分子機(jī)制進(jìn)行深入研究和解析將有助于人們進(jìn)一步了解生物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和如何適應(yīng)環(huán)境的。精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶在生殖系統(tǒng)中的功能，以及對(duì)生殖系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制還需我們花費(fèi)更多的努力及時(shí)間來探尋。