梅 晨，李淑芳，黃明明，孫愛華，龔玉梅，王宏俊

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀100097)

副雞禽桿菌(Apg)是雞傳染性鼻炎(IC)的致病菌，可以引起雞打噴嚏、流出稀薄水樣鼻涕，之后出現(xiàn)眼結(jié)膜和面部腫脹，甚至上下眼皮粘合在一起等癥狀。病雞消瘦，下痢，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量急劇下降，可達(dá)40%[1]。該病常與雞毒支原體[2]、大腸桿菌等混合感染，引起更為嚴(yán)重的損失。僅憑臨床癥狀難以做出準(zhǔn)確診斷，建立快速準(zhǔn)確的診斷方法是副雞禽桿菌病防控的前提，血清抗體監(jiān)測對雞傳染性鼻炎的有效防治非常必要。

Page等人通過血凝抑制(HI)方法將Apg分類為A、B和C型3種型，并且發(fā)現(xiàn)3種血清型之間沒有交叉保護(hù)[3]。Takagi M等人報(bào)道了利用型特異性單克隆抗體的競爭ELISA，以此代替HI試驗(yàn)的血清學(xué)診斷法[4-5]。該方法靈敏度高，具有一次處理多個(gè)樣本的優(yōu)點(diǎn)。但是，采用該方法需要確保型特異性單克隆抗體、血清樣本中的抗體都可以和同一個(gè)表位結(jié)合，由于菌體的變異而失去該表位時(shí)，則無法檢測菌體感染或疫苗接種所產(chǎn)生的抗體，該方法易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。上述血清型檢測方法還不能用于免疫效果監(jiān)測。

有文獻(xiàn)顯示，副雞禽桿菌外膜蛋白HMTp210的部分片段非常保守，不同血清型間同源性很高，本研究在篩選鑒定副雞禽桿菌的外膜蛋白[6]的基礎(chǔ)上，利用其具有保守性抗原的特性，包被酶標(biāo)板并建立間接ELISA檢測方法，該方法能夠檢出針對Apg的A型菌、B型菌和C型菌的雞血清抗體。對評價(jià)疫苗免疫效果及雞只對副雞禽桿菌的防疫水平具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株及血清 副雞禽桿菌A、B、C三個(gè)血清型的標(biāo)準(zhǔn)株由本實(shí)驗(yàn)室保存。Apg的A型菌、B型菌和C型單因子雞血清和P9蛋白抗血清分別由對應(yīng)菌株或抗原人工接種SPF雞制得，由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。大腸桿菌O1、O2、O78亞型以及禽流感(AI)H9亞型、新城疫(ND)LaSota株(NDLa)和F48株(NDf48)、雞傳染性法氏囊病(IBD)、減蛋綜合征(EDS’76)等禽病病原單因子陽性雞血清及SPF雞血清等，均由本實(shí)驗(yàn)室保存或制備，支原體抗MG-S6 株陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。120份臨床樣本血清采自河北某蛋雞場120日齡雞，該雞群分別在56日齡和90日齡用雞傳染性鼻炎三價(jià)滅活疫苗進(jìn)行了免疫。

紅細(xì)胞凝集反應(yīng)用抗原(HA抗原): 副雞禽桿菌A型(Hp8株)、B型(BJ株)和 C型(668株)HA抗原，HA效價(jià)均為1∶160；副雞禽桿菌A型陽性血清、B型陽性血清和C型陽性血清, 紅細(xì)胞凝集抑制(HI)抗體價(jià)為1∶80 ～ 1∶160；10%戊二醛固定的雞醛化紅細(xì)胞，以及血清稀釋液(含0.1% BSA的0.01 mol/L pH值7.0 PBS)，以上材料均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 主要試劑和儀器 酶標(biāo)板為NUNC 公司產(chǎn)品，HRP 標(biāo)記兔抗雞IgG抗體產(chǎn)自Sigma公司;TMB 顯色液產(chǎn)自KPL 公司;酶標(biāo)儀(Molecular Devices，SPECTRA MAX190)。

1.3 方法

1.3.1 抗原蛋白P9的制備及純化 利用生物信息學(xué)軟件Geneious(Biomatters. Ltd，網(wǎng)址http://www.geneious.com/)，通過對副雞禽桿菌外膜蛋白HMTp210的基因(GenBank No. KJ867497)篩選分析，選取氨基酸序列從第1090到1648的肽段，命名為P9，由華大基因科技(北京)服務(wù)有限公司進(jìn)行全基因合成并原核表達(dá)。通過對P9編碼基因的PCR擴(kuò)增、與表達(dá)載體pET30a連接等步驟構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-P9。將pET30a-P9轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)后超聲裂解上清用鎳親和層析柱純化，獲得純化的P9蛋白。

1.3.2 陰性血清及P9蛋白抗血清的制備 重組抗原蛋白P9與MONTANIDE ISA 71 VG佐劑(SEPPIC公司產(chǎn)品)按3∶7重量比混合乳化(操作方法見SEPPIC公司產(chǎn)品使用方法介紹)，使疫苗中抗原蛋白終濃度為20 μg/mL，所制備的疫苗命名為vP9。免疫方法：取42日齡SPF雞，分為2組，30只/組。其中一組為疫苗免疫組，分別胸部注射所述vP9疫苗0.5 mL/只；另一組為非免疫對照組。第1次免疫后間隔4周，對所有免疫組的雞進(jìn)行二次免疫，劑量及免疫途徑與首次免疫相同。所有試驗(yàn)雞每周于翅靜脈采血1次，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 間接ELISA方法的建立

1.3.3.1 抗原包被濃度及血清稀釋度的選擇 采用棋盤滴定法，用0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(PBS,pH值9.6)依次按以下比例稀釋P9抗原(0.5 mg/mL)：依次做50、100、500、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000倍稀釋，包被反應(yīng)板100 μL/孔，橫向包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜；PBST(PBS+1%tween20,pH值7.4)清洗3遍后加入封閉液(5%脫脂乳，PBS配制)，37 ℃封閉2 h，PBST清洗3遍。陽性血清及陰性血清分別用稀釋液(1%脫脂乳，PBS配制)從1∶50進(jìn)行倍比稀釋(1∶50 ～ 1∶400)，100 μL/孔，縱向加入封閉后的抗原包被板中，其余試驗(yàn)步驟均按ELISA方法進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)副雞禽桿菌陽性血清值OD450 nm值為1.0左右，陰性O(shè)D450 nm值設(shè)為0.1左右的范圍選擇P/N值最大為最佳稀釋條件。

1.3.3.2 最佳血清抗體孵育時(shí)間篩選 將血清用稀釋液稀釋至相應(yīng)濃度后加入抗原包被板，100 μL/孔，分別37 ℃孵育0.5 h、1 h、2 h，其余試驗(yàn)步驟均按ELISA方法進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果選擇P/N 值最大為最佳孵育時(shí)間。

1.3.3.3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度及時(shí)間確定 完成血清孵育并清洗后，以稀釋液分別稀釋HRP 標(biāo)記兔抗雞IgG抗體至1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000，100 μL/孔，分別37 ℃孵育0.5 h、1 h，其余試驗(yàn)步驟均按ELISA方法進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果選擇P/N值最大為最佳條件。

1.3.3.4 顯色時(shí)間確定 酶標(biāo)二抗孵育結(jié)束并清洗后，加入TMB顯色液，100 μL/孔，放置于37 ℃孵育5、10、15、20 min后加入2 mol/L H2SO4終止讀數(shù)，50 μL/孔。選擇P/N值最大時(shí)最佳顯色時(shí)間。

1.3.4 臨界值的確定 在優(yōu)化間接ELISA的最佳條件后，使用該方法對30份陰性血清進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測樣品的OD450 nm值平均值和標(biāo)準(zhǔn)差設(shè)定該間接ELISA方法的判定值：X+3 s；待檢樣品的OD450 nm值若大于判定值，則該樣品為陽性，反之，則判為陰性。

1.3.5 交叉反應(yīng)性試驗(yàn) 采用標(biāo)記為Hp8(A型)、0221(A型)、0083(A型)、0222(B型)、BJ(B型)、668(C型)、Modesto(C型)等不同血清型副雞禽桿菌分別單獨(dú)感染的雞血清作為待測陽性血清，未經(jīng)免疫的SPF雞血清為陰性血清，各個(gè)血清樣本做3個(gè)平行重復(fù)測試，用于評價(jià)本方法的交叉反應(yīng)性。

1.3.6 特異性檢驗(yàn) 應(yīng)用已建立的間接ELISA方法，對常見的大腸桿菌O1、O2、O78株，禽流感(AI) H9亞型、新城疫(ND)LaSota株(NDla)和F48株(NDf48)、減蛋綜合征(EDS’76)、雞毒支原體MG-S6等禽病病原的陽性血清進(jìn)行檢測，并以標(biāo)準(zhǔn)副雞禽桿菌陽性血清為陽性對照，測定OD450 nm值，各個(gè)血清樣本做3個(gè)平行重復(fù)測試，確定該方法的特異性。

1.3.7 ELISA方法檢測田間血清樣品 本試驗(yàn)建立的ELISA方法，對所收集的臨床免疫雞血清，進(jìn)行測定。各個(gè)血清樣本做3個(gè)平行重復(fù)，計(jì)算OD值，并依照本試驗(yàn)所設(shè)標(biāo)準(zhǔn)判定檢測結(jié)果。

1.3.8 ELISA方法與HI試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)室收集的120份臨床樣品用HI試驗(yàn)進(jìn)行對比試驗(yàn)，分別用3個(gè)血清型的HA抗原進(jìn)行檢測，方法如下[7]：用血清稀釋液將吸附后的血清作2倍系列稀釋,第1孔為1∶5，第2孔為1∶10, 依此類推,共作8個(gè)稀釋度(1∶5,1∶10,1∶20，…，1∶640)，每孔含有50 μL稀釋血清。在各管中加入4個(gè)HA單位的HA抗原50 μL, 充分混勻后在室溫作用20 min,然后每管加入1%雞紅細(xì)胞50 μL, 充分混勻后在室溫靜置60 min, 判定結(jié)果, 以完全抑制HA的血清最高稀釋度為血清的HI效價(jià)。若試驗(yàn)血清的HI效價(jià)≥5,即判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 抗原蛋白P9的制備及純化 本試驗(yàn)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將其誘導(dǎo)表達(dá)后超聲裂解，如圖1所示，誘導(dǎo)后重組菌大量表達(dá)P9蛋白，且P9蛋白大部分存在于裂解后的上清中。如圖2所示，經(jīng)鎳柱純化后，獲得純度較高的蛋白P9，純度80%。

圖1 P9重組菌株蛋白表達(dá)圖

M：Marker ; 1：重組菌誘導(dǎo)后裂解沉淀 ; 2：重組菌 誘導(dǎo)后裂解上清 ; 3：誘導(dǎo)前重組菌

圖2 P9蛋白純化

M：Marker；1：P9蛋白純化后

2.2 間接ELISA方法建立 經(jīng)棋盤滴定，結(jié)果表明,當(dāng)血清最佳稀釋度為1∶100，包被抗原的濃度為1 μg/mL時(shí)P/N值最高；以5 %脫脂奶為稀釋液稀釋血清后加入孔內(nèi)反應(yīng)60 min時(shí)P/N值為最高，以此確定血清樣品孵育時(shí)間為60 min；以1 %脫脂奶為稀釋液稀釋酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min，稀釋比例為1∶10 000；底物顯色時(shí)間為15 min。

2.3 ELISA判定值的確定 對30份陰性的雞血清進(jìn)行ELISA方法檢測，測得陰性血清的平均OD值為0.097，標(biāo)準(zhǔn)差為0.066，因此ELISA方法的判定值為0.295。當(dāng)樣品OD值≥0.295時(shí)，判定為陽性。為便于判斷，設(shè)定OD450值=0.3為本方法的陽性臨界值。

2.4 ELISA方法的交叉反應(yīng)性結(jié)果 使用本試驗(yàn)建立的間接 ELISA 方法分別檢測SPF雞陰性血清、Hp8、0221、0083、0222、BJ、668、Modesto等副雞禽桿菌菌株的陽性雞血清，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠檢出針對不同血清型的副雞禽桿菌陽性血清，具有較好的交叉反應(yīng)性。如圖3所示。

圖3 重組P9蛋白的交叉反應(yīng)性

2.5 ELISA方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)測定，本文所建立的ELISA方法檢測大腸桿菌O1、O2、O78；AI、NDf48、NDla、EDS′ 76、MG-S6等病原體的特異性陽性血清，OD450值均小于0.1，為陰性(圖4)。表明本文所建立的ELISA方法具有較好的特異性。

圖4 ELISA方法的特異性試驗(yàn)

2.6 臨床樣品的檢測結(jié)果 ELISA結(jié)果顯示，本方法測得的田間血清樣品120份均為陽性，OD450值均大于0.3，平均約為0.45，說明所建立的ELISA方法可以用來檢測雞傳染性鼻炎疫苗免疫后的抗體水平。

HI試驗(yàn)檢測同批樣品，針對A型、B型和C型的HA抗原，分別有98份、80份和85份樣品顯示為陽性，其中65份樣品HI檢測結(jié)果為A、B、C全部陽性，陽性樣品HI滴度為1∶5～1∶20之間。其余樣品呈現(xiàn)A型、B型或C型部分陰性，或全部是陰性的結(jié)果。

3 討論

目前對雞傳染性鼻炎病原的檢測常用PCR法[8-9]、血清抗體檢測方法常用血凝抑制(HI)方法和單克隆抗體的競爭ELISA等方法，實(shí)際應(yīng)用中都存在一定局限性[10-12]。

血凝素是副雞禽桿菌的一種抗原蛋白成分，處理或不經(jīng)過處理的副雞禽桿菌具有凝集雞紅細(xì)胞的能力。因此，實(shí)踐中利用HI試驗(yàn)對副雞禽桿菌進(jìn)行分型和測定抗體水平。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HI抗體水平與雞群免疫保護(hù)率沒有直接的相關(guān)性。換言之，血凝素可能并非副雞禽桿菌的保護(hù)性抗原核心成分。和眾多革蘭陰性致病菌類似，外膜蛋白可能是副雞禽桿菌的關(guān)鍵性抗原成分，本研究開展了外膜蛋白在免疫及抗體檢測方面的研究。

HMTp210是副雞禽桿菌的一個(gè)外膜蛋白，其中含有高變區(qū)Region 2，血清型間同源性只有40%或更低，Region1和Region 3同源性則高達(dá)98%以上[13-14]，本研究中選取的P9蛋白位于Region 2和Region 3之間，是血清型間較為保守的片段，同時(shí)具有很好的免疫原性，免疫后可以產(chǎn)生較高的血清抗體效價(jià)，便于檢測。

本試驗(yàn)使用純化的外膜蛋白作為抗原，該方法用一種抗原蛋白可實(shí)現(xiàn)對Apg的A型菌、B型菌以及C型菌3種血清型抗體的檢測，不必采用對應(yīng)血清型的抗原，簡化了抗體檢測步驟。與以往的菌體破碎物包被方法相比[15]，包被抗原純度高。重組外膜蛋白可以與不同血清型副雞禽桿菌單因子陽性血清發(fā)生反應(yīng)，而與其他常見病原的陽性血清，如大腸桿菌O1、O2、O78；H9亞型禽流感、新城疫、減蛋綜合征、雞傳染性囊病、雞毒支原體等沒有交叉反應(yīng)，該檢測方法特異性優(yōu)于全菌抗原包被的ELISA方法。

同時(shí)，由于P9外膜蛋白可以交叉檢測出A、B、C三型副雞禽桿菌的血清抗體，該蛋白也可能用作亞單位疫苗的候選抗原，我們將在可行性方面做進(jìn)一步探討。