黨盛源，劉超男，高雪麗，姜 南，趙良友，呂曉萍，鄭世民

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030；2.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，黑龍江哈爾濱150040)

禽流感(AI)是由禽流感病毒(AIV)感染機(jī)體引起的病理綜合征。其中H5N1亞型AIV屬于高致病性。近些年，該病毒在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)引起鴨、鵝等水禽流感暴發(fā)。研究證實(shí)，H5N1亞型AIV可通過(guò)禽類傳染人類。不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，更為嚴(yán)重的是給人類健康和生命帶來(lái)巨大威脅。雛雞免疫器官細(xì)胞免疫在AIV感染中的作用迄今缺乏系統(tǒng)研究報(bào)道，故本研究對(duì)H5N1亞型AIV感染7日齡SPF雛雞后，其胸腺、脾臟、法氏囊的細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)，探討H5N1亞型AIV的免疫致病機(jī)制，為AIV免疫防制提供科學(xué)可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 CSIRO-MVS品系SPF混合雛雞70只，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 禽流感病毒(AIV) 鵝源H5N1亞型AIV中強(qiáng)毒株，血凝價(jià)為26，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.3 主要試劑 鼠抗雞CD4(MAC-CD4)和CD8(MAC-CD8)單克隆抗體，Inc產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品； Con A，CNI公司；MTT，Sigma公司；α-甲基-D-甘露糖苷，Amresco公司；3，3—二氨基聯(lián)苯二胺鹽酸鹽和醋酸-1-萘酯，上海試劑一廠；副品紅，上海試劑三廠；胰蛋白酶，上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠。上述化學(xué)試劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及處理 70只SPF雛雞隨機(jī)分為病毒感染組(I組)和對(duì)照組(C組)。其中I組雛雞于7日齡時(shí)經(jīng)眼、鼻、口途徑感染1∶100稀釋的病毒稀釋液，劑量為L(zhǎng)D50/只；C組雛雞通過(guò)上述相同途徑給予相同劑量的高壓滅菌PBS。2組雛雞分別飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心負(fù)壓隔離器內(nèi)，按SPF雛雞要求飼養(yǎng)管理。動(dòng)物試驗(yàn)部分在國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室完成。

1.4.2 被檢材料采取及處理 分別于AIV感染后1、3、4、5、7、14 d和2 d，每組隨機(jī)抽取5只雛雞。稱重，心臟采血處死，快速無(wú)菌采取部分胸腺、脾臟分別分離制備相應(yīng)淋巴細(xì)胞懸液，用于T淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。另取一部分胸腺、脾臟及法氏囊固定于4 ℃的10%中性福爾馬林中，經(jīng)一系列處理后用于其余相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4.3 被檢指標(biāo)及方法 (1)免疫器官T細(xì)胞采用組織石蠟切片及酶組織化學(xué)法[1]檢測(cè)，CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)使用組織石蠟切片及免疫組織化學(xué)法[2]檢測(cè);(2)胸腺和脾臟T淋巴細(xì)胞對(duì)Con A的增殖功能檢測(cè)—組織細(xì)胞培養(yǎng)及MTT檢測(cè)法[3];(3)AIV感染SPF雛雞發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 AIV感染SPF雛雞免疫器官T細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化 AIV感染SPF雛雞后，其胸腺、法氏囊和脾臟的T淋巴細(xì)胞數(shù)量分別于病毒感染后3～5 d、4～7 d和4～5 d較對(duì)照雛雞明顯減少(P<0.05或P<0.01)，且法氏囊T淋巴細(xì)胞在第21天也顯著低于對(duì)照雛雞(P<0.05)。其他未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AIV感染SPF雛雞免疫器官T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103個(gè)/mm2)

注：(1)C表示對(duì)照組；I表示AIV感染組。(2)**表示P<0.01，*表示P<0.05；無(wú)標(biāo)記表示P>0.05；下表同

2.2 AIV感染7日齡SPF雛雞胸腺和脾臟T細(xì)胞增殖功能變化 SPF雛雞感染AIV后1～21 d，其胸腺T細(xì)胞增殖能力均不同程度的低于對(duì)照雛雞，其中3～7 d差異明顯(P<0.05或P<0.01)；脾臟T細(xì)胞增殖能力于3～5 d明顯低于對(duì)照雛雞(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 AIV感染SPF雛雞胸腺和脾臟T細(xì)胞增殖功能變化 (OD590nm值)

2.3 AIV感染7日齡SPF雛雞胸腺CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化 AIV感染SPF雛雞后3～4 d，其胸腺皮質(zhì)CD4+、CD8+T細(xì)胞均明顯低于對(duì)照雛雞(P<0.05 或P<0.01)；髓質(zhì)CD4+、CD8+T細(xì)胞分別于病毒感染后4～7 d、3～4 d明顯減少(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 AIV感染7日齡SPF雛雞胸腺CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103/mm2)

2.4 AIV感染7日齡SPF雛雞脾臟CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化 AIV感染SPF雛雞后1～21 d，其脾臟紅髓中CD4+、CD8+T細(xì)胞均不同程度地低于對(duì)照雛雞。其中CD4+T細(xì)胞于4～5 d明顯下降(P<0.05或P<0.01)；CD8+T細(xì)胞于第4天極顯著(P<0.01)減少。白髓中CD4+、CD8+T細(xì)胞分別于病毒感染后4～5 d、5～7 d較對(duì)照雛雞顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低。淋巴小結(jié)CD4+T細(xì)胞于病毒感染后4～5 d較對(duì)照雛雞極顯著(P<0.01)下降；CD8+T細(xì)胞于3～5 d減少尤為明顯(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表4。

2.5 AIV感染7日齡SPF雛雞胸腺和脾臟CD4+與CD8+T細(xì)胞比值變化 AIV感染SPF雛雞后3～5 d，其胸腺皮質(zhì)CD4+與CD8+T細(xì)胞比值明顯低于對(duì)照雛雞(P<0.05或P<0.01)；髓質(zhì)CD4+與CD8+T細(xì)胞比值于病毒感染后第3天顯著下降(P<0.05)。

脾臟紅髓CD4+與CD8+T細(xì)胞比值均于病毒感染后3～5 d明顯(P<0.05或P<0.01)低于對(duì)照雛雞；白髓CD4+與CD8+T細(xì)胞比值于病毒感染后1～3 d較對(duì)照雛雞顯著(P<0.05或P<0.01)下降。見(jiàn)表5。

表4 AIV感染7日齡SPF雛雞脾臟CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化 (×103/mm2)

表5 AIV感染7日齡SPF雛雞胸腺和脾臟CD4+與CD8+T細(xì)胞比值變化 (×103/mm2)

2.6 AIV感染7日齡SPF雛雞發(fā)病和死亡情況 AIV感染SPF雛雞全部發(fā)病，呈現(xiàn)典型的AI臨床癥狀，發(fā)病率為100%，第3、4、7天各死亡3只，第5天死亡2只，其余天數(shù)各死亡1只，死亡率達(dá)40%，對(duì)照雛雞未見(jiàn)異常。見(jiàn)表6。

表6 AIV感染7日齡SPF雛雞發(fā)病和死亡情況

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，H5N1亞型AIV感染7日齡SPF雛雞后，無(wú)論是中樞還是外周免疫器官的T淋巴細(xì)胞不僅數(shù)量減少，而且其對(duì)Con A的增殖功能也程度不同地低于對(duì)照雛雞。表明AIV感染對(duì)SPF雛雞免疫器官的細(xì)胞免疫功能具有抑制作用。AIV侵入細(xì)胞后可誘導(dǎo)多種培養(yǎng)細(xì)胞或組織細(xì)胞凋亡[4-6]。孫正陽(yáng)等[4]研究表明，鵝源H5N1亞型AIV感染雛鴨后，腔上囊出血、充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少。另有研究報(bào)道，AIV感染21日齡雛雞，其血液中T細(xì)胞數(shù)量顯著減少[7]，外周血液細(xì)胞免疫和體液免疫功能下降是機(jī)體免疫器官免疫功能低下的外在表現(xiàn)，而免疫器官免疫功能減弱或喪失是外周血液免疫功能改變的基礎(chǔ)或根源。本研究結(jié)果與葛南海等[8]、王穎彥等[9]和張瑞莉等[10]的研究報(bào)道基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，病毒感染雛雞后不僅胸腺及脾臟的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量均不同程度地減少，且CD4+/CD8+值也顯著下降，表明AIV感染SPF雛雞免疫器官的細(xì)胞免疫水平降低或被抑制，該類被檢測(cè)指標(biāo)迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。鄭世民等[3]研究發(fā)現(xiàn)，AIV感染雛雞后胸腺與脾臟的IL-2和IFN在一定時(shí)間內(nèi)均低于對(duì)照雛雞，表明AIV感染所致胸腺和脾臟T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少與相應(yīng)細(xì)胞因子含量降低、細(xì)胞免疫水平下降密切相關(guān)。Tumpey T M等[11]研究發(fā)現(xiàn)，由人體分離的H5N1亞型病毒感染小鼠后，T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。金梅花等[12]報(bào)道，病毒主要通過(guò)誘導(dǎo)MHC-I類分子遞呈抗原激活CD8+，而CD4+細(xì)胞克隆增殖明顯慢于MHC-I類分子遞呈抗原激活的CD8+細(xì)胞。AIV具有高度保守的核衣殼蛋白(NP)，是誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的主要抗原[13]。病毒入侵機(jī)體后，激活CD8+T細(xì)胞， CD4+與CD8+T細(xì)胞數(shù)量均處于顯著減少狀態(tài)，導(dǎo)致CD4+/CD8+值顯著下降。H5N1亞型AIV極有可能是通過(guò)削弱CD4+T細(xì)胞的免疫功能影響細(xì)胞因子進(jìn)而延長(zhǎng)病毒感染時(shí)間和/或加重了病毒感染雛雞的病情，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。

4 結(jié)論

H5N1亞型AIV感染可引起SPF雛雞免疫器官的細(xì)胞免疫功能下降，該變化不僅是導(dǎo)致感染雛雞免疫機(jī)能低下的主要因素，也與病毒感染雛雞死亡密切相關(guān)。