劉宇寧,楊珍,周治文, 查文良, 孔東波

湖北科技學(xué)院 1藥學(xué)院，2臨床醫(yī)學(xué)院(湖北咸寧 437100); 3咸寧市中心醫(yī)院(湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院)泌尿外科(湖北咸寧 437100)

近年來，隨著人們生活水平的提高，高脂飲食所造成的肥胖癥逐漸成為一個普遍的社會問題，它嚴(yán)重威脅著人們的健康，并可導(dǎo)致雄性激素分泌減少、睪丸發(fā)育異常、精子數(shù)量和質(zhì)量下降等生殖系統(tǒng)損傷的發(fā)生，然而其具體發(fā)生機(jī)制未明?，F(xiàn)有研究認(rèn)為睪丸組織中的氧化還原平衡對于維持睪丸的正常生理功能具有十分重要的意義。然而，睪丸組織中含有大量的不飽和脂肪酸，且抗氧化能力較差，脂肪的過度攝入會增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)和脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物從而促進(jìn)氧化應(yīng)激水平，最終導(dǎo)致睪丸損傷和生精功能的扭曲[1]。此外，方芳等[2]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食大鼠睪丸細(xì)胞周期阻滯和凋亡增加，從而導(dǎo)致睪丸生精細(xì)胞分裂和增殖減少。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是中醫(yī)經(jīng)典方劑，已流傳超過800年，主要由當(dāng)歸和黃芪熬制而成，具有補(bǔ)氣生血之療效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明當(dāng)歸中含有大量的阿魏酸，具有增加冠狀動脈血流量、抗血小板凝聚等作用，同時發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗氧化能力[3]。本實(shí)驗(yàn)從2018年4月至2019年3月通過高脂飲食建立肥胖模型，探究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對大鼠睪丸的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥品與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SPF級wistar雄性大鼠50只(110±10)g，購于北京維通利華公司(動物合格證號：SCXK(京)2016-0006)。在室溫(22±2)℃、濕度40%的動物房，晝夜節(jié)律12 h適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食飲水。

1.1.2 藥品與試劑 當(dāng)歸與黃芪購于湖北科技學(xué)院第二附屬醫(yī)院；高脂飼料(80.3%普通飼料+10%豬油+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉)購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司；羅格列酮購自成都恒瑞制藥有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；Beclin-1、LC3B、Bax、Bcl-2多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器 電子天平、3-18K高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)、正置熒光顯微鏡(德國Leica公司)、多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan spark公司)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國伯樂ChemiDoc)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及給藥方法 大鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=10)、高脂模型組(n=10)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組(n=10)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組(n=10)、羅格列酮對照組(n=10)。除正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，不限制飲水。當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、高劑量組每天同一時間段分別灌胃6、12 g/kg當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎液(低劑量：將黃芪∶當(dāng)歸按5∶1的比例稱取105 g藥材于8倍體積純水中浸泡1 h后加熱至沸騰后計時煎煮1 h，濾過殘?jiān)罅砑?倍體積純水繼續(xù)煎煮1 h，混勻2次濾液于95℃水浴濃縮成210 mL當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎液，冷藏備用；高劑量：按同比例稱取210 g藥材同法煎至210 mL當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎液，冷藏備用)，羅格列酮對照組每天灌胃羅格列酮溶液4 mg/kg，喂養(yǎng)12周。

1.2.2 精子計數(shù)及活力統(tǒng)計 將麻醉后的大鼠左側(cè)附睪尾部取出置于37℃生理鹽水中剪碎混勻，取部分混勻液于清潔玻片上置于高倍光學(xué)顯微鏡下分別計數(shù)5個視野的活躍及不活動精子數(shù)，計算精子活動率(精子活動率=活躍精子數(shù)/總精子數(shù)×100%)。吸取精子懸液加入37℃生理鹽水中混勻后滴入細(xì)胞計數(shù)板，計數(shù)中央5個中方格的精子數(shù)，用平均數(shù)乘以109即為每升精液中的精子數(shù)。

1.2.3 光鏡觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)變化 睪丸組織通過bouin′s固定液固定過夜后，石蠟包埋，蠟塊切片，HE染色后光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 大鼠睪丸組織中MDA及SOD含量測定 取大鼠睪丸組織按1∶9加入生理鹽水研磨后制得10%生理鹽水勻漿，按照試劑盒說明書操作步驟用酶標(biāo)儀測得樣本OD值后，計算出樣本MDA及SOD含量。

1.2.5 Western免疫印跡技術(shù) 稱取約50 mg大鼠睪丸組織后加入含有蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液冰浴研磨30 min后取上清液測定蛋白濃度，電泳轉(zhuǎn)膜后孵育不同濃度的一抗，顯影后應(yīng)用image lab軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 精子計數(shù)及精子活力統(tǒng)計 與正常對照組比較，高脂模型組大鼠精子活力及數(shù)量均顯著降低(P<0.05)；當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、高劑量組大鼠的精子數(shù)量與活力顯著增加，與高脂模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；羅格列酮對照組的精子活力有所上升，然而精子總數(shù)水平較低，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與當(dāng)歸補(bǔ)血湯相比療效較差，見表1。

2.2 睪丸組織顯微結(jié)構(gòu)變化 正常對照組大鼠睪丸曲細(xì)精管有完整的被膜，生精上皮的各級生精細(xì)胞排列有序，多數(shù)為6～7層，曲細(xì)精管管腔內(nèi)可見大量精子。高脂模型組大鼠睪丸曲細(xì)精管萎縮、變形，生精上皮的細(xì)胞層次顯著減少，排列紊亂，多為3～4層，曲細(xì)精管內(nèi)可見脫落的生精細(xì)胞，精子生成明顯減少。當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、高劑量組大鼠睪丸曲細(xì)精管形態(tài)與正常對照組類似，生精上皮損害明顯減輕，并有精子生成。羅格列酮對照組部分層次恢復(fù)，但仍有生精細(xì)胞脫落，且無明顯精子生成，見圖1。

組別精子活力(%)精子濃度(×109·L-1)正常對照組59.7±11.52.5±0.5高脂模型組29.0±10.4?1.3±0.3?當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組41.8±9.9△2.8±0.5△當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組44.7±4.7△3.4±0.5?△羅格列酮對照組46.1±8.5△0.8±0.3?

*與正常對照組比較P<0.05; △與高脂模型組比較P<0.05

2.3 睪丸組織SOD和MDA檢測結(jié)果 與正常對照組比較，高脂模型組SOD水平明顯降低，MDA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高脂模型組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、高劑量組以及羅格列酮對照組SOD水平升高，MDA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4 睪丸組織相關(guān)蛋白表達(dá)變化 與正常對照組比較，高脂模型組Bax/Bcl-2比值以及Beclin-1、LC3B蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高脂模型組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯低、高劑量組大鼠睪丸組織中Bax/Bcl-2比值以及Beclin-1、LC3B蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與正常對照組比較，羅格列酮對照組Bax/Bcl-2比值較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2、表3。

A:正常對照組；B:高脂模型組；C:當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組；D:當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組；E:羅格列酮對照組

圖1各組睪丸組織顯微結(jié)構(gòu)變化(HE，×400)

組別SOD(U/mL)MDA(nmol/L)正常對照組43.3±3.933.9±4.5高脂模型組37.4±0.7?45.7±7.8?當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組45.5±1.4△31.3±7.2△當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組47.8±3.4△25.4±11.4△羅格列酮對照組49.0±4.5△30.1±7.8△

*與正常對照組比較P<0.05; △與高脂模型組比較P<0.05

圖2 各組大鼠睪丸組織相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

隨著生活節(jié)奏的加快，快餐及油炸食品等高油高脂的食物成為了現(xiàn)在社會的主流餐飲，然而高脂飲食給人們帶來的不止是肥胖，同時對人體的心血管、神經(jīng)、生殖能力等諸多方面帶來不利的影響。肥胖將影響男性生殖功能已經(jīng)被證實(shí)，然而越來越多的證據(jù)表明未達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)的高脂飲食人群的生殖能力較正常飲食的人群相差很多[4]。在Togo等[5]的研究中高脂飲食誘導(dǎo)11周后大鼠出現(xiàn)了肥胖癥狀，在機(jī)體自我調(diào)節(jié)的作用下大鼠的血脂與正常組相比沒有顯著性差異，但脂質(zhì)代謝的負(fù)擔(dān)仍影響了大鼠線粒體超氧陰離子的產(chǎn)生和膜流動性的穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂飲食不僅減少大鼠精子活力與精子濃度，而且可使睪丸曲細(xì)精管萎縮、變形，生精上皮的細(xì)胞層次減少；然而，當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療后可顯著改善大鼠精子活力與精子濃度，減輕大鼠生精上皮損害，這些結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對高脂飲食大鼠的睪丸損傷具有保護(hù)作用。羅格列酮對大鼠睪丸具有保護(hù)作用，可以防止外界刺激對睪丸組織的損傷[6]，同時有文獻(xiàn)報道指出羅格列酮可以顯著改善因高脂飲食引起的線粒體損傷[7]。同時羅格列酮作為工業(yè)化產(chǎn)品具有穩(wěn)定的藥效，因此我們將羅格列酮作為陽性對照藥物與當(dāng)歸補(bǔ)血湯一同長時間服用，以此來比較當(dāng)歸補(bǔ)血湯對高脂飲食造成的睪丸損傷的修復(fù)作用和療效穩(wěn)定性。

組別Bax/Bcl-2LC3B/GAPDHBeclin-1/GAPDH正常對照組1.00±0.031.00±0.111.00±0.12高脂模型組3.13±0.40?1.29±0.09?1.47±0.10?當(dāng)歸補(bǔ)血湯低劑量組1.76±0.26△0.99±0.10△1.20±0.10△當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組1.31±0.18△0.87±0.02△0.94±0.23△羅格列酮對照組2.35±0.46?1.09±0.431.08±0.46

*與正常對照組比較P<0.05; △與高脂模型組比較P<0.05

過多的油脂攝入將導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)大量的脂質(zhì)堆積和ROS積累，而ROS能攻擊生物體內(nèi)的多不飽和脂肪酸而引起生殖細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化和線粒體損傷，導(dǎo)致睪丸精子發(fā)生和類固醇生成功能障礙[8]，進(jìn)而影響雄性生物精子濃度與精子活力明顯降低，精子畸形率增高，同時伴有血睪屏障的破壞[9]?，F(xiàn)代藥物化學(xué)研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯中富含總多糖、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、當(dāng)歸多糖、阿魏酸等物質(zhì)，具有顯著的抗氧化功能。阿魏酸是姜黃素的衍生物，具有類似姜黃素的抗氧化功能，可以降低機(jī)體內(nèi)MDA水平、提高SOD含量，進(jìn)而發(fā)揮其對機(jī)體的治療保護(hù)作用[10-11]。本研究結(jié)果顯示高脂模型組睪丸組織中MDA含量顯著升高而SOD活力下降，給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療可使睪丸組織MDA水平明顯下降而SOD活力顯著提高，提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過改善氧化應(yīng)激從而有效地恢復(fù)雄性個體生育能力。

大量的研究已證實(shí)氧化應(yīng)激可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。細(xì)胞凋亡主要由凋亡誘導(dǎo)基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2共同調(diào)控，Bax/Bcl-2 比例失衡可激活下游Caspase信號通路從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，最終引發(fā)生精功能的障礙。高脂飲食可致睪丸促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3表達(dá)升高，而Bcl-2表達(dá)降低，睪丸細(xì)胞凋亡增加。本研究與穆楊等[12]研究結(jié)果相符，高脂模型組睪丸組織中Bax/Bcl-2比值增加，當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療與羅格列酮相比更顯著降低其比值，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過改善氧化應(yīng)激抑制睪丸細(xì)胞凋亡發(fā)生。

自噬是真核細(xì)胞中發(fā)生的一個自我清除過程，正常的自噬過程可以幫助生物體內(nèi)細(xì)胞的生長平衡，特別是對因高血糖和缺氧引起的睪丸損傷具有保護(hù)作用[13]。然而異常自噬被認(rèn)為參與了諸多相關(guān)疾病的發(fā)病進(jìn)程，自噬不足或過度自噬將導(dǎo)致生殖細(xì)胞退化，同時會降解線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器從而破壞睪丸的穩(wěn)態(tài)，影響睪丸的生長發(fā)育及其發(fā)揮正常的生理功能[14]。研究發(fā)現(xiàn)動物長期高脂飲食將引起細(xì)胞氧化/抗氧化平衡失調(diào)，ROS的產(chǎn)生將抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1并導(dǎo)致自噬相關(guān)基因4因氧化而失活，使得自噬相關(guān)基因8產(chǎn)生脂化在細(xì)胞內(nèi)形成自噬體而誘導(dǎo)自噬[15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂模型組的大鼠睪丸組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3B表達(dá)增加，表明高脂飲食將誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生，而給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療后大鼠睪丸組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯下降，相比于羅格列酮修復(fù)線粒體功能更好。

綜上所述，高脂飲食可導(dǎo)致大鼠生精功能障礙、氧化應(yīng)激、自噬以及凋亡水平增加。當(dāng)歸補(bǔ)血湯通過提高大鼠抗氧化能力、抑制自噬以及凋亡發(fā)生從而保護(hù)大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)與功能，深入研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對高脂飲食人群睪丸功能的保護(hù)作用將為臨床防治生殖功能損傷提供新的解決思路。