唐靖雯 盧禮平 李嬌嬌 楊 桃 潘 梅

貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550018

當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒由當(dāng)歸、熟地黃、川芎、黨參、白芍、甘草、黃芪等7味藥材組成，收載入《中國藥典》2015年版。具有補(bǔ)血助氣、調(diào)經(jīng)的功效，用于貧血衰弱、病后、產(chǎn)后血虛以及月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)。本研究在當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒含糖型基礎(chǔ)上，完成了其無糖型產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究并建立了企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為廣大患者提供了一個治療痛經(jīng)的產(chǎn)品。為保證臨床用藥的安全、有效以及更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用薄層色譜法對制劑中當(dāng)歸、川芎、甘草、黃芪、白芍等5味藥材進(jìn)行定性鑒別；建立了以制劑中白芍的主要活性成分芍藥苷為指標(biāo)性成分的HPLC含量測定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器、ChemStation色譜工作站、1200型自動進(jìn)樣器(美國Agilent公司)；AG135型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；CH-250型超聲波清洗機(jī)(天津恒奧科技公司，功率：250W，頻率：40KHz)；硅膠G(青島海洋化工廠分廠，批號：20150701)。

1.2 藥品與試劑 無糖型當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒(批號：170501、170502、170503，貴州威門藥業(yè)股份有限公司)；芍藥苷對照品(批號：110736-201741，中國食品藥品檢定研究院)；磷酸(批號：10015408，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈為色譜純；乙酸乙酯、三氯甲烷、冰醋酸、環(huán)己烷、無水乙醇均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 當(dāng)歸、川芎的鑒別 取本品10 g，研細(xì)，加水30 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次(水液備用)，每次使用20 mL，將兩次乙醚提取液合并，揮干乙醚提取液，殘渣加l mL甲醇使完全溶解，作為供試品溶液。分別取當(dāng)歸、川芎藥材，按照供試品溶液的制備方法分別制成當(dāng)歸、川芎對照藥材溶液。另按制劑的處方比例稱取適量缺當(dāng)歸、川芎藥材的其他各味藥材，按該制劑的制備工藝制成顆粒，取顆粒適量，按上述制備供試品溶液的操作方法制成缺當(dāng)歸、川芎藥材的陰性樣品。照薄層色譜法(2015年版中國藥典四部，通則0502)，分別依次吸取上述當(dāng)歸對照藥材、川芎對照藥材、陰性樣品、供試品溶液各4 μL，分別依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，選用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)的溶液為展開劑進(jìn)行展開，取出硅膠板后放置晾干，將晾干的硅膠G薄層板置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果，當(dāng)歸的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)完全一致，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾。如圖1所示。

2.1.2 甘草的鑒別 取本品10 g，研細(xì)，加乙醚40 mL，超聲處理30 min，濾過，棄去乙醚液，殘渣揮干乙醚，加水40 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 mL，分取正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇l mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草藥材及缺甘草的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法分別制成甘草對照藥材溶液、缺甘草的陰性樣品溶液。照薄層色譜法(2015年版中國藥典四部，通則0502)，分別吸取上述甘草對照藥材、陰性樣品、供試品溶液各6 μL，分別依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，選用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)的溶液為展開劑進(jìn)行展開，取出硅膠板后放置晾干，將晾干的硅膠G薄層板置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果，當(dāng)歸的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)完全一致，且陰性無干擾。如圖2所示。

2.1.3 黃芪的鑒別 取“2.1.1”項下的備用水溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，分取正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇l mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每l mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。另取缺黃芪的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺黃芪的陰性樣品溶液。照薄層色譜法(2015年版中國藥典四部，通則0502)，分別吸取上述黃芪苷對照品、陰性樣品、供試品溶液各6 μL，分別依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，選用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液作為展開劑，取出硅膠板后放置晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別在日光及紫外光(365 nm)下檢視。結(jié)果，黃芪的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)完全一致，日光下顯相同顏色的斑點(diǎn)，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾。如圖3、圖4所示。

2.1.4 白芍的鑒別 取本品10 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇l mL使溶解，作為供試品溶液。取芍藥苷對照品，加乙醇制成每l mL含l mg 的溶液，作為對照品溶液。另取缺白芍的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺白芍的陰性樣品溶液。照薄層色譜法(2015年版中國藥典四部，通則0502)，分別吸取上述芍藥苷對照品、陰性樣品、供試品各10 μL，分別依次點(diǎn)于同一硅膠薄層板，選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑進(jìn)行展開，取出硅膠板后放置晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，白芍的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現(xiàn)的斑點(diǎn)完全一致，與芍藥苷對照品相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)，且陰性無干擾。如圖5所示。

2.2 芍藥苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-0.1%磷酸溶液(12∶88，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液[2]取裝量差異項下的本品，研細(xì)，從中取約2.5 g藥物粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL使溶解，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.2 對照品溶液 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成每1 mL含35 μg的溶液，既得。

2.2.2.3 缺白芍的陰性樣品 按處方稱取缺白芍的群藥，按上述供試品溶液的制備方法制成缺白芍的陰性樣品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗[3-5]精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、缺白芍的陰性樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算>3000，分離度>1.5。色譜如圖6所示。

2.2.4 線性關(guān)系 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋制成0.2192 mg/mL的溶液，分別精密量取0.5、1、2、4、8、16 μL至25 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋刻度。按“2.2.1”項下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，以各對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸?；貧w方程：A= 14.254C-25.694，r=0.9998。結(jié)果表明，對照品溶液濃度在(4.38～140.16)μg/mL范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取樣品(批號170501)，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄芍藥苷的峰面積。結(jié)果，峰面積RSD為0.28%，表明儀器精密度較好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取樣品(批號170501)，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測定記錄色譜峰。結(jié)果，峰面積的RSD為1.72%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號170501)6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計算芍藥苷的含量。結(jié)果，含量的RSD為1.96%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知芍藥苷含量的當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒(無糖型，批號：170501，含量為0.3427 mg/g)，采用加樣回收法，測定本方法的回收率。精密稱取本批次當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒1.25 g，分別精密吸取芍藥苷對照品溶液(35.20 μg/mL)10 mL，按“2.2.2”項下的方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，計算白芍苷的加樣回收率，結(jié)果詳見表1。

2.2.9 樣品含量的測定 取3批樣品(批號170501、170502、170503)各適量，按 “2.2.2”項下方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL注入HPLC儀，按“2.2.1”項下色譜條件記錄色譜圖；另取“2.2.2”項下對照品溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算供試品的含量，結(jié)果詳見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

表2 樣品含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

研究對制劑中當(dāng)歸、川芎進(jìn)行TLC 定性鑒別時，按照文獻(xiàn)方法：分別用正己烷-乙酸乙酯(9∶1)、正己烷-乙酸乙酯(4∶1)作為展開劑進(jìn)行TLC定性鑒別，結(jié)果供試品色譜中均未顯示斑點(diǎn)。在多次嘗試的基礎(chǔ)下發(fā)現(xiàn)，以兩種溶劑作為展開劑時始終無法獲得理想的展開效果，故最終選擇采用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)的4種溶劑作為展開劑，所得的供試品色譜中斑點(diǎn)也較為清晰。

制劑中當(dāng)歸、白芍的主要活性成分分別為阿魏酸、芍藥苷，在含量測定的指標(biāo)性成分如何選取過程中，考慮到君藥當(dāng)歸中阿魏酸含量較低，故選擇含量較高、成分較穩(wěn)定的活性成分芍藥苷作為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法測定白芍中芍藥苷的含量。但由于中藥制劑成分復(fù)雜且該制劑中白芍所占比例小等因素，僅以白芍中芍藥苷作為指標(biāo)性成分來控制該制劑質(zhì)量明顯不足，因此在后續(xù)的研究中，應(yīng)優(yōu)化臣藥中阿魏酸的提取方法，增加制劑中阿魏酸提取量，建立多指標(biāo)性成分的含量測定方法，以更有效地控制該制劑的質(zhì)量。

綜上，本研究建立的質(zhì)量控制分析方法，經(jīng)過對多批產(chǎn)品的驗證，結(jié)果表明該質(zhì)量控制方法簡便、準(zhǔn)確，可用于當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒(無糖型)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制，能有效地保證產(chǎn)品臨床用藥的安全性、有效性和可控性。