張美慧 李瑞海

遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600

姜系姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根莖，是一種廣泛應用的藥食兩用植物。干姜是姜的干燥品，味辛性熱，歸脾、胃、腎、心、肺經(jīng)，溫中散寒，回陽通脈，燥濕消痰，主治脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、肢冷脈微、痰飲喘咳[1]。

目前，對干姜中其他類有效成分研究較為廣泛，對氨基酸類成分研究較少。氨基酸為人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，對于它的研究尤為必要。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，也是構(gòu)成人體內(nèi)最基本物質(zhì)之一。氨基酸在人體內(nèi)通過代謝可以發(fā)揮一些作用，比如合成組織蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔锖椭咀兂伤?、激素、抗體、肌酸等含氨物質(zhì)氧化成二氧化碳、水和尿素，產(chǎn)生能量。氨基酸在人體中的存在，不僅為合成蛋白質(zhì)提供了重要原料，而且為促進生長，進行正常代謝、維持生命提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。

本實驗采用柱前衍生化高效液相色譜法檢測干姜中不同氨基酸的含量，并對不同產(chǎn)地的干姜藥材中18種氨基酸進行含量測定，以期為干姜藥材的質(zhì)量評價及氨基酸含量研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 P230II大連依利特氨基酸自動分析儀；UV230II紫外檢測器(大連依利特公司)；ALC-110.4電子分析天平(北京賽多利斯特儀器系統(tǒng)有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；SF-130B高速粉碎儀器機(上海冠聯(lián)制藥裝備有限公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試藥與材料 18種氨基酸對照品(批號：20100108，中國藥品生物制品檢定所)；2,4-二硝基氟苯(大連依利特公司)。乙腈為色譜純；冰醋酸、N,N-二甲基酰胺為分析純；水為純凈水。干姜經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學尹海波教授鑒定符合藥典要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 流動相的配制 A相：乙腈-水(1∶1)；B相：固體組分B[l1]4.1g加水950 mL，冰醋酸調(diào)pH至6.4～6.8，加10 mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1000 mL量瓶中，搖勻后過濾，備用。

2.2 色譜條件[3]色譜柱：ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm，大連依利特)；柱溫：27 ℃；檢測波長360 nm；流速1.2 mL/min，梯度洗脫，流動相梯度洗脫曲線見表1。

表1 流動相梯度洗脫曲線

2.3 衍生緩沖溶液的配制 取衍生緩沖溶液固體組分A[l2]1.24 g；固體組分B[l3]7.63 g，加水定容至500 mL量瓶中，搖勻，備用。

2.4 平衡緩沖溶液的配制 取平衡緩沖溶液固體組分A[l4]0.91；固體組分B[l5]3.58 g，加水定容至250 mL量瓶中，搖勻，備用。

2.5 對照品溶液的制備 氨基酸對照品適量(丙氨酸5.1 mg、組氨酸5.0 mg、脯氨酸4.9 mg、精氨酸5.3 mg、亮氨酸5.6 mg、絲氨酸4.8 mg、天門冬氨酸5.3 mg、異亮氨酸4.8 mg、蘇氨酸5.0 mg、半胱氨酸5.0 mg、賴氨酸5.0 mg、色氨酸5.1 mg、谷氨酸5.0 mg、蛋氨酸4.9 mg、纈氨酸4.9 mg、甘氨酸4.9 mg、苯丙氨酸5.6 mg、酪氨酸2.7 mg)，精密稱取，加衍生緩沖溶液定容至25 mL容量瓶中，精密吸取1 mL，加衍生緩沖溶液定容至10 mL容量瓶中，備用。

2.6 供試品溶液的制備 取樣品粉末0.2 g，精密稱定，置具塞試管中，加3 mL 6 mol/L鹽酸溶液[4]，混勻，置烘箱110 ℃中水解24 h。水解后樣品多次用水洗滌從具塞試管轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，80 ℃水浴加熱蒸干。衍生緩沖溶液多次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用衍生緩沖溶液定容，混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾。取已過濾的樣品液2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加入衍生化試劑1 mL，放入60 ℃水浴中暗處反應1 h，取出冷卻至室溫，加平衡緩沖溶液定容至刻度，靜置15 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.7 標準曲線的繪制 取2.5項下25 mL容量瓶中對照品溶液0.01、0.50、1.00，1.50、2.00 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，分別加入衍生化試劑0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按“2.6”方法制備。進樣量為20 μL按照“2.2”項下色譜條件，進樣測定，以各個氨基酸對照品溶液的進樣量為橫坐標X(μg)，相對應的峰面積值為縱坐標Y，繪制標準曲線，各個氨基酸的回歸方程及線性范圍見表2。

表2 各氨基酸成分的回歸方程及線性范圍

續(xù)表2

表2 各氨基酸成分的回歸方程及線性范圍

2.8 方法學考察

2.8.1 精密度試驗 取對照品溶液，按“2.2”色譜條件，連續(xù)進樣6次測定，各峰面積的RSD均≤2.00%，表明精密度良好。

2.8.2 重現(xiàn)性試驗 取樣品6份適量(過40目篩，每份約200 mg)，精密稱定，按“2.6”方法制備供試品溶液，按“2.2”色譜條件進樣測定，計算樣品中各氨基酸的含量，結(jié)果RSD≤2.0%，表明此方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗 取四川供試品溶液，按“2.2”色譜條件，于2、4、8、10、12、24 h進樣測定，各色譜峰的相對峰面積的RSD均≤2.00%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.4 加樣回收率試驗 分別取已知含量的四川樣品6份粉末適量(過40目篩，每份約100 mg)，精密稱定并分別加入對照品溶液適量(從天冬氨酸至酪氨酸分別加入對照品1.1845、1.8030、0.9485、1.3275、0.5860、4.3495、0.6835、1.0175、1.7905、2.1670、2.1805、0.9495、1.0640、0.2230、0.9290、2.3285、0.9680、0.2080 mg)，按照“2.6”方法制備供試品溶液，按照“2.2”色譜條件，進樣測定，計算加樣回收率的RSD均≤2.00%。

2.9 干姜樣品含量測定 分別精密吸取各供試品溶液5 μL，按“2.2”的色譜條件，進樣測定，依據(jù)標準曲線回歸方程，計算各氨基酸的含量見表3。對照品及樣品色譜圖如圖1，圖2所示。

表3 干姜18種氨基酸的含量

續(xù)表3

表3 干姜18種氨基酸的含量

3 討論

研究可知，干姜中含有所檢測的18種氨基酸，并包括人體必需的8種氨基酸即組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸及纈氨酸。可見，干姜中所含的氨基酸種類十分豐富。

產(chǎn)地為四川、貴州省的干姜中所含人體必需氨基酸總量相對較高，分別達到113.85 mg/g、104.47 mg/g。廣東省、山東省、云南省人體必需氨基酸總量較低，分別為82.77 mg/g、 63.58 mg/g、13.86 mg/g。其中，產(chǎn)地為云南的干姜所含人體必需氨基酸總量最低。產(chǎn)地為四川、貴州省的干姜中所含氨基酸總量相對較高，分別達到247.39 mg/g、250.21 mg/g。廣東省、山東省、云南省氨基酸總量較低，分別為208.85 mg/g、 200.97 mg/g、76.83 mg/g。其中，產(chǎn)地為云南的干姜所含氨基酸總量最低。

不同產(chǎn)地干姜中含有的不同氨基酸含量有較大差異。相比于其他四省，四川干姜中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的含量最高。貴州干姜中精氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、絡氨酸含量最高。廣東省、山東省、云南省干姜中各氨基酸含量稍低，五省干姜中不同氨基酸含量差異明顯。鑒于本次實驗樣品數(shù)量較少，擬增加樣本數(shù)，再進行實驗研究。本實驗所建立的干姜的18種氨基酸含量測定方法，方法簡單、易行，適用于干姜的氨基酸成分的質(zhì)量控制。