崔 妍，許傳鵬，齊 欣，徐文英，閆平平，田 卓，王 煜

（1.大連出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，遼寧 大連 116600；2.中檢（大連）測試技術有限公司，遼寧 大連 116600）

菌落總數(shù)是食品檢樣經(jīng)過處理、在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后所得每克（毫升）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)[1]。菌落總數(shù)測定常用來判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品做出適當?shù)男l(wèi)生學評價。菌落總數(shù)在一定程度上標志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。

原料乳營養(yǎng)豐富，適宜人類食用，但其較高的水分含量和接近中性的pH值也非常適合細菌、霉菌和酵母菌等各類微生物的生長和繁殖[2]，這些微生物的存在有的可以使乳及乳制品產(chǎn)生理想風味，有的則會引起乳及乳制品腐敗變質(zhì)，從而導致人類患病[3-5]。因此，監(jiān)測原料乳的微生物指標至關重要。GB 19301—2010《食品安全國家標準 生乳》[6]對原料乳的菌落總數(shù)做出要求，其限量為2×106CFU/g（mL），而菌落總數(shù)檢測結果的分散性給原料乳微生物限量的判定帶來了一定困難，為乳制品生產(chǎn)加工企業(yè)的食品質(zhì)量安全管理尤其是源頭管理帶來了挑戰(zhàn)。

目前，國際上普遍使用CNAS-CL01《檢測和校準實驗室能力認可準則（ISO/IEC 17025:2017）》[7]對實驗室的管理和技術能力進行規(guī)范要求，2018版的認可準則中指出，適當時，尤其是涉及結果符合性判定時，應對測量結果進行不確定度評定。CNAS-CL01-A001《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》[8]也規(guī)定了在微生物檢測領域，某些情況下，考慮到對于檢測結果的重要性，需要列出各主要的不確定度分量，并作出合理評估。

對菌落總數(shù)檢測結果進行不確定度評定是實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的一部分，對提供準確可靠的數(shù)據(jù)及由數(shù)據(jù)得出的符合性判定具有重要意義。本研究通過檢測10 份原料乳的菌落總數(shù)，按照CNAS-CL01-G003《測量不確定度的要求》[9]和GB/T 27418—2017《測量不確定度評定和表示》[10]分析檢測結果中不確定度的來源，并對檢測結果進行不確定度評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從某乳品企業(yè)抽取10 批次新鮮原料乳。

平板計數(shù)瓊脂 北京陸橋技術股份有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

KMF 7.2（E5.2）恒溫恒濕培養(yǎng)箱（控溫范圍0～70℃）德國Binder公司；400SW拍擊式均質(zhì)器法國Interscience公司；CL-40M高壓蒸汽滅菌鍋 日本Alp公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數(shù)檢測

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[1]，無菌取樣25 mL，置于225 mL磷酸鹽緩沖液中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液；再用1 mL微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注入盛有9 mL稀釋液的無菌試管中，混合均勻，制成1∶100的樣品勻液；按上述操作，選擇2～3 個適宜稀釋度的樣品勻液，制備10 倍系列稀釋樣品勻液，每個稀釋度做2 個平皿，同時分別吸取1 mL空白稀釋液加入2 個無菌平皿作為空白對照；及時將15～20 mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻；待瓊脂凝固后，將平板翻轉，置于（36±1）℃條件下培養(yǎng)（48±2）h；培養(yǎng)結束后，計算菌落總數(shù)。

1.3.2 不確定度評定方法

參照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[11]評定合并標準偏差和標準不確定度，對測試過程產(chǎn)生的不確定度分量進行評估，從而評定其不確定度。

1.3.3 測定模型和不確定度來源分析

1.3.3.1 測定模型

菌落總數(shù)按公式（1）[12]計算。

式中：Y為單次測定的菌落總數(shù)/（CFU/mL）；F為樣品的稀釋倍數(shù)；N為1 mL樣品稀釋液中的菌落數(shù)/（CFU/mL）；V為樣品稀釋液的體積/mL。

1.3.3.2 不確定度分量確認

測量不確定度一般由若干分量組成，其中，對在規(guī)定測量條件下測得的量值用統(tǒng)計分析方法進行的測量不確定度分量評定稱為測量不確定度的A類評定，用不同于測量不確定度A類評定的方法對測量不確定度分量進行的評定稱為測量不確定度的B類評定。本研究將樣品稱量、樣品移液和樣品稀釋等過程作為測量不確定度的B類評定分量進行評定。

2 結果與分析

2.1 樣品制備過程引入的不確定度

2.1.1 樣品稱量引入的不確定度

在樣品制備過程中，將25 mL樣品加入225 mL磷酸鹽緩沖溶液制得體積比1∶10的初始稀釋液。使用25 mL和250 mL量筒量取，根據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量器》[13]中的規(guī)定，25 mL量入式量筒的容量允差絕對值為0.25 mL，250 mL量入式量筒的容量允差絕對值為1.0 mL，按照三角分布考慮，包含因子則量取25 mL樣品時，B類標準不確定度uB（V1）、相對標準不確定度urel（V1）按式（2）～（3）計算。

量取225 mL磷酸鹽緩沖溶液時，B類標準不確定度uB（V2）、相對標準不確定度urel（V2）按式（4）～（5）計算。

2.1.2 樣品稀釋過程中引入的不確定度

將體積比1∶10的樣品初始稀釋液逐級稀釋，得到體積比依次為1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107的樣品勻液。稀釋過程使用移液器移取1 mL和9 mL各級稀釋樣品勻液，按照JJG 646—2006《移液器》[14]的要求，均有相應的容量允許誤差絕對值，本研究使用的移液器均符合標準要求，查詢移液器的校準證書，按照三角分布考慮由此估算樣品稀釋過程中B類標準不確定度uB（d）和相對標準不確定度urel（d），結果如表1所示。

表1 樣品勻液逐級稀釋過程中量具校準引起的標準不確定度uB（ d）和相對標準不確定度urel（ d）Table1 Standard uncertainty uB( d)and relative standard uncertainty urel( d)caused by gauge calibration during successive dilution

不同的檢測結果，樣品逐級稀釋的程度不同，得到的相對標準不確定度不同。

以樣品1為例，樣品最終稀釋體積比為1∶107，根據(jù)樣品稱量引入的不確定度urel（V1）、urel（V2）和表1逐級稀釋過程中量具校準引起的相對標準不確定度urel（d）計算，樣品1稀釋過程中引入的urel（d）如式（6）所示。

以樣品2為例，樣品最終稀釋體積比為1∶104，樣品2逐級稀釋過程引入的相對標準不確定度urel（d）如式（7）所示。

2.1.3 加樣體積的不確定度

加樣體積為1 mL，本研究使用的移液器符合JJG 646—2006《移液器》[14]的要求，查詢得到，移液器校準證書上的容量允許誤差絕對值為0.8%，即0.008 mL，按照三角分布考慮則B類標準不確定度uB（V3）、相對標準不確定度urel（V3）分別按式（8）～（9）計算。

2.1.4 菌落總數(shù)測定的相對標準不確定度

菌落總數(shù)的相對標準不確定度urel（T）由樣品逐級稀釋引起的相對標準不確定度urel（d）和加樣體積引入的相對標準不確定度urel（V3）組成。

以樣品1為例，菌落總數(shù)測定的相對標準不確定度urel（T）如式（10）所示。

以樣品2為例，菌落總數(shù)測定的相對標準不確定度urel（T）如式（11）所示。

2.2 樣品菌落總數(shù)測定時引入的標準不確定度

表2 10 個樣品菌落總數(shù)的測定結果Table2 Summary of results obtained for the determination of aerobic plate count in 10 samples

對10 個樣品進行菌落總數(shù)測定，每個樣品做2 個平行樣。由表2可知，從測定結果分析，計算得出的測定結果相差極大，直接用測定結果得到標準偏差來評定不確定度的方法并不合理，因此將測定結果取對數(shù)值[15-17]，評定其合并樣本標準偏差[18-19]，并計算A類標準不確定度。合并樣本標準偏差按式（12）計算。

式中：Sp為合并樣本標準偏差；m為樣品數(shù)量；n為平行樣數(shù)量。

因樣品進行2 次平行實驗，所以樣品菌落總數(shù)測定時的A類標準不確定度uA（）如式（13）所示。

2.3 合成標準不確定度

合成標準不確定度uc（Y）由標準不確定度uA（）和相對標準不確定度urel（T）合并按式（14）計算。

在95%的包含概率下，包含因子k=2，則擴展不確定度為u=kuc（Y）=2uc（Y），根據(jù)lgxj計算每個樣品的菌落總數(shù)范圍，結果如表3所示。

表3 10 個樣品菌落總數(shù)測定的不確定度及菌落總數(shù)范圍Table3 Measurement uncertainty and aerobic plate count ranges of 10 samples

3 討 論

3.1 菌落總數(shù)測定不確定度評定的重要性

菌落總數(shù)用于判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，在一定程度上標志著食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，是原料乳重要的微生物控制指標。不確定度是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數(shù)[11]，在測試過程中，對于測試結果在限量標準附近的樣品進行符合性評價時，應根據(jù)CNAS-GL015《聲明檢測或校準結果及與規(guī)范符合性的指南》[20]進行評價。從本研究的結果可以看出，若不考慮不確定度對測定結果的影響，樣品4為合格樣品，而考慮不確定度后，則只有在包含概率＜95%時，才能判定樣品合格。由此可見，測量不確定度的評定可以使實驗室提供的數(shù)據(jù)更具有效性、科學性、公正性和可靠性。

3.2 不確定度評定數(shù)學模型的建立

在化學檢測分析中主要以定量檢測為主，且待測樣品的化學物質(zhì)具有均一性，化學領域測量不確定度評定的方法研究較為成熟，如CNAS-GL006《化學分析中不確定度的評估指南》[21]對化學檢測的不確定度評定作出詳細的規(guī)范要求，而微生物檢測測定的是活的物質(zhì)，樣品的代表性差、微生物分布不均及不同菌落間的互生或拮抗等相互作用給微生物檢測帶來很多不確定性，這些都為微生物檢測測量不確定度評定帶來困難[22-23]。一些評定使用Y=X的數(shù)學模型[24-26]，沒有考慮到稀釋過程和體積對菌落總數(shù)測定不確定度的影響，顯然缺乏合理性。本研究將對菌落總數(shù)不確定度評定有主要影響的3 個分量（F、N、V）建立數(shù)學模型，對不同批次、同一類型樣品進行不確定度評定。今后，可將菌落生長率、計數(shù)誤差、樣品的不穩(wěn)定性等分量加入數(shù)學模型，對菌落總數(shù)不確定度評定進行深入討論。

3.3 計算公式的選擇

如果是對同一樣品進行多次測量來評定不確定度，可以直接使用貝塞爾公式[27-29]，但此方法較為費工耗材，不適用于日常檢測。日常檢測時多為不同樣品，其菌落總數(shù)測定結果發(fā)散性較大，可以將檢測結果取對數(shù)后計算合并樣本標準偏差，評定不確定度[30-33]。本研究討論的是不同批次的同一類型樣品，當評定不同類型樣品時，需要考慮樣品種類和性質(zhì)不同帶來的差異。日常檢測工作中，在標準操作規(guī)程和同等檢測環(huán)境下，將種類相同或相似的樣品分類并進行不確定度評定，可隨時按類別將新的測定結果輸入合并計算評定，對測試樣品進行符合性評價。

3.4 其他不確定度分量

在微生物檢測中，除了本研究的不確定度分量外，還有樣品的采集、均質(zhì)、培養(yǎng)基的制備等不確定度分量，而這些不確定度分量不便于計算且對總不確定度的貢獻較小，因此本研究在評定中不予考慮，對于這些不確定度分量可以通過制定作業(yè)指導書來統(tǒng)一規(guī)范人員操作，從而最大程度減少由此帶來的不確定度。

4 結 論

測量不確定度表示測試結果在包含概率下的分布區(qū)間，是衡量測試結果準確性和可靠性的重要參數(shù)。測量不確定度的評定有利于檢測人員分析測試結果與真值的差距，了解測量水平。由于微生物的特性，食品安全法中規(guī)定微生物檢驗不能復檢，而菌落總數(shù)的測試結果是衡量產(chǎn)品質(zhì)量是否合格的重要依據(jù)，當測試結果接近限量標準時，為了使測試結果客觀準確，需要對測試結果進行測量不確定度評定，避免各方因測量條件的不同對測試結果引起爭議，有效降低檢測風險并保證食品安全。