王焙，張登科，史詠梅，吳迪迪，李勇勇，婁永江

(寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波，315211)

抗菌肽是一種新型的生物防腐劑，易被人體消化水解[1]，且具有無毒副作用、無污染、無殘留、熱穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。目前研發(fā)的溶菌酶、乳酸鏈球菌素[3]等對革蘭氏陽性菌具有明顯抗菌性，已廣泛應(yīng)用于陸生動物食品中。但對革蘭氏陰性致病菌占優(yōu)勢的海洋食品來說，相關(guān)報(bào)道較少[4]。

我國漁業(yè)資源豐富，近年來以海洋中上層魚類為原料生產(chǎn)魚罐頭的產(chǎn)業(yè)不斷壯大，在加工過程中產(chǎn)生大量的暗色肉，其富含豐富的蛋白質(zhì)及堿性氨基酸[5]，適合開發(fā)成抗菌肽。本文以鰹魚暗色肉為原料，對其進(jìn)行酶解優(yōu)化[6]，并對酶解產(chǎn)物粗肽進(jìn)行分離純化和抑菌活性測定，以期獲得一種具有產(chǎn)業(yè)化前景、抑制海洋食品中革蘭氏陰性致病菌的抗菌肽，為海洋中上層魚類暗色肉的精深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮凍鰹魚(Katsuwonuspelamis)，市售；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、希瓦氏菌(Shewanella)，南京茂捷微生物科技有限公司；堿性蛋白酶(地衣芽胞桿菌產(chǎn))、胰蛋白酶、中性蛋白酶(枯草芽孢桿菌產(chǎn))、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶(黑曲霉產(chǎn))、胃蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司；MH肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基，杭州微生物科技有限公司；牛血清白蛋白，生工生物工程股份有限公司；干酪素，上海麥克林生化科技有限公司；酪氨酸，中國食品藥品檢定研究院；福林酚，上海國藥試劑集團(tuán)；NaCl(分析純)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、NaOH(分析純)、HCl(分析純)；HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution，通用電氣GE醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部。

UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；超濾離心管，上海雷布斯科技有限公司；麥?zhǔn)媳葷峁埽虾０猩锟萍加邢薰?；THZ-100型恒溫?fù)u床、DHP-9012B型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F型超凈工作臺、XR1臺式高速冷凍離心機(jī)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；雷磁PHS-3G pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；L-8900高效氨基酸自動分析儀，上海天齊生物科技有限公司；MK3型酶標(biāo)儀，上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AKTA avent 150 蛋白質(zhì)分離純化系統(tǒng)，通用電氣GE醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

取鮮凍鰹魚，置于20 ℃條件下自然解凍，解凍完成后去除其內(nèi)臟、頭后蒸熟，挑選魚背部顏色較深的肉即為暗色肉，將暗色肉置于-40 ℃的超低溫冰箱中凍藏。

1.2.2 酶解方法

取100 g解凍后的蒸熟的鰹魚暗色肉于燒杯中，加入蒸餾水，調(diào)pH值，置于恒溫水浴鍋中保溫，加酶水解6 h。不同種類蛋白酶統(tǒng)一加酶量4 000 U/g，暗色肉和蒸餾水的料液比1∶5(g∶mL)，酶解溫度、pH條件如表1所示。酶解結(jié)束后，在沸水浴中滅酶10 min，冷卻，10 000 r/min低溫離心10 min，取上清液于4 ℃冰箱冷藏備用，用于測定水解度和抑菌率。

表1 各類酶的酶解條件Table 1 Enzymolysis conditions for various enzymes

1.2.3 單因素試驗(yàn)

按照1.2.2方法制備鰹魚暗色肉抗菌肽。以肽濃度和對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率為指標(biāo)，選擇抑菌對象，從堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中選擇合適的蛋白酶及抑菌對象。以抑菌率為指標(biāo)，考察料液比(1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9,g∶mL)，酸性蛋白酶酶解pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)、酶解溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)、加酶量(2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g)以及酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)對酶解產(chǎn)物對大腸桿菌抑菌率的影響，確定各個酶解條件的最適值。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)。選取對大腸桿菌的抑菌率作為響應(yīng)值，優(yōu)化酶解條件。響應(yīng)面因素編碼及水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Response surface experiment factors and levels

1.2.5 可溶性肽的測定

采用三氯乙酸沉淀結(jié)合Folin-酚法測定可溶性肽[7]。取5 mL酶解液于離心管中，加入5 mL 100 g/L三氯乙酸(trichloroacetic acid solution, TCA)溶液，靜置20 min，10 000 r/min離心10 min，取1 mL稀釋一定倍數(shù)的上清液(定量范圍為5～100 μg蛋白質(zhì))，加入5 mL堿性銅溶液，搖勻，常溫下靜置10 min，加入0.5 mL Folin試劑并迅速混勻，顯色反應(yīng)，在30 ℃水浴鍋中放置30 min，測定650 nm處吸光值。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出肽得率。

(1)

Folin-酚試劑A：堿性銅溶液；甲液：取2 g Na2CO3，溶于100 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中；乙液：取0.5 g CuSO4·5H2O晶體，溶于100 mL 1%酒石酸鉀中。臨用時按V(甲液)∶V(乙液)=50∶1混合使用。

1.2.6 抑菌活性的測定

將制備好的酶解液進(jìn)行過濾除菌(0.22 μm水相微孔濾膜)后[8-9]，取100 μL酶解液至96孔酶標(biāo)板中，加入100 μL無菌生理鹽水，作為空白組；100 μL酶解產(chǎn)物液加入96孔酶標(biāo)板中，再加入100 μL用LB培養(yǎng)基稀釋為1.0×105CFU/mL的大腸桿菌菌懸液[12]，作為試驗(yàn)組；在96孔酶板上加入100 μL無菌生理鹽水，加入用LB培養(yǎng)基稀釋為1.0×105CFU/mL的100 μL菌懸液，作為對照組。分別將空白組、試驗(yàn)組、對照組置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)法測定620 nm下的吸收率。水解液的抑菌率按公式(2)計(jì)算[10]：

抑菌率/%=

(2)

1.2.7 超濾

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到的粗肽凍干樣品，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的樣液。采用截留分子量分別為5、10 kDa的超濾膜對樣液進(jìn)行超濾離心初步分離。超濾條件為[11]：溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速4 000 r/min、離心時間30 min。收集濾液，冷凍干燥，備用。

1.2.8 凝膠色譜層析-Sephacryl S-100 HR分離純化

稱取凍干的樣品200 mg，于10 mL 0.05 mol/L Na3PO4、0.15 mol/L NaCl、pH 7.0的緩沖液中溶解，配制溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL，通過0.22 μm過濾器過濾。其余的工作液也需通過0.22 μm過濾器過濾。先用0.15 mol/L NaCl、pH 7.0、0.05 mol/L Na3PO4的緩沖液對Sephacryl S-100 HR凝膠柱進(jìn)行平衡，設(shè)壓力最大值為0.15 MPa,紫外值歸0，流速設(shè)為0.5 mL/min，平衡2個柱體積直至紫外吸收值趨于平穩(wěn)，待平衡后上樣。進(jìn)樣條件為：上樣量1mL，流速0.5 mL/min，壓力最大值0.15 MPa，紫外波長280 nm。將有吸收峰的餾分進(jìn)行收集，冷凍干燥，備用。

1.2.9 最小抑菌濃度的測定(minimum ihibitory concentration，MIC)

采用微量二倍稀釋法[12-13]測定暗色肉抗菌肽對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌、希瓦氏菌的最小抑菌濃度。通過麥?zhǔn)媳葷岱ㄈ√幱趯?shù)生長期的致病菌，用MH肉湯培養(yǎng)基將菌液稀釋至105CFU/mL。將滅好菌的酶標(biāo)板的每個孔中加入100 μL MH肉湯培養(yǎng)基，在第1孔中加入質(zhì)量濃度為320 μg/mL抗菌肽溶液100 μL，然后對抗菌肽溶液進(jìn)行二倍稀釋。即，第一孔中加入抗菌肽液后用移液槍反復(fù)吹打4次使之與肉湯充分混勻，然后吸取100 μL至第二孔中再充分吹打混勻，重復(fù)至最后一孔，從第8列吸出100 μL棄掉。使抗菌肽溶液質(zhì)量濃度依次調(diào)節(jié)為：320、160、80、40、20、10、5、2.5 μg/mL，共做3次平行。接著在一排孔中再加入100 μL MH肉湯培養(yǎng)基，作為陰性對照。在另一排孔中加入100 μL菌液作為陽性對照。將希瓦氏菌的酶標(biāo)板放入28 ℃的恒溫箱，其余放入37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)放置12 h后，觀察結(jié)果。若有菌生長，孔板底部會出現(xiàn)白色沉淀。MIC值的判定：96孔板橫排中未有沉淀的最后一孔所對應(yīng)的濃度為該抗菌肽液的MIC值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SAS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行差異性分析，其中P<0.05 差異顯著，P<0.01 差異極顯著；用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖，每次試驗(yàn)設(shè)計(jì)3～5個平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用Design-expert 8. 0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選

2.1.1 不同蛋白酶酶解液抑菌率分析

如圖1、2所示，隨著酶解時間的進(jìn)行，酸性蛋白酶對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最大抑菌率分別達(dá)到(66.18±1.44)%和(52.33±1.13)%，經(jīng)單因素差異性分析，酸性蛋白酶酶解液對大腸桿菌抑菌率顯著大于其他蛋白酶(P<0.05)。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的抑菌效果最差，木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物在初期階段幾乎沒有抑菌活性。施永清等[14]通過酶解制備魚鱗抗菌肽時，酸性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物對大腸桿菌的抑菌效果較好。吳林澤等[15]用堿性蛋白酶酶解羅非魚下腳料，以金黃色葡萄球菌為指示菌，獲得的粗肽具有很好抑菌性。各個蛋白酶在不同酶解時間段得到的酶解產(chǎn)物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均有所不同[11]，可能與蛋白酶的特異性有關(guān)[16-17]，中性蛋白酶[18]、酸性蛋白酶[19]以及堿性蛋白酶[20]的酶切作用范圍廣，主要作用于C-端的某些疏水性氨基酸殘基，導(dǎo)致疏水性基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，易被水解，暴露出具有抑菌活性的氨基酸序列，獲得更多活性多肽，而木瓜蛋白酶[21]和胰蛋白酶[22]主要作用于蛋白質(zhì)N-端的親水性氨基酸(Arg-、Lys-)殘基，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，水解不完全，無法獲得較多的活性肽[23]。因此本實(shí)驗(yàn)選取酸性蛋白酶制備抗菌肽。

圖1 各類蛋白酶酶解液對大腸桿菌的抑菌率Fig.1 Antibacterial rate of various protease hydrolysates on Escherichia coli注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

圖2 各類蛋白酶酶解液對金黃色葡萄球菌的抑菌率Fig.2 Antibacterial rate of various protease hydrolysates on Staphylococcus aureus

2.1.2 不同蛋白酶酶解液肽得率分析

肽得率反映底物經(jīng)蛋白酶水解得到的可溶性多肽占總蛋白的比例。得率越高表明獲得的可溶性多肽越多，經(jīng)濟(jì)效益也就越高。由圖3可知，5種蛋白酶水解液中肽得率總體上均隨反應(yīng)時間的延長先上升后趨于平緩，原因可能是酶解反應(yīng)初期，蛋白酶作用的蛋白質(zhì)酶切位點(diǎn)比較多，隨后快速水解，短時間內(nèi)暗色肉蛋白質(zhì)上的肽鍵被大量切斷[24]，釋放出較多的可溶性肽及少數(shù)的游離氨基酸到溶液中，隨后待水解的底物減少，使肽得率趨于穩(wěn)定[25]。在整個水解過程中，多肽的產(chǎn)率由大到小依次為中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。通過單因素差異性比較分析，肽得率較高的中性蛋白酶顯著高于其他種類蛋白酶(P<0.05)。

圖3 各類蛋白酶酶解鰹魚暗色肉過程中可溶性肽得率Fig.3 The yield of soluble peptide in the process of enzymatic hydrolysis of squid dark meat by various proteases

從可溶性肽得率和抑菌率綜合考慮，選取酸性蛋白酶制備抗菌肽并以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行下一步的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 鰹魚暗色肉酸性蛋白酶水解單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對抑菌活性的影響

在酸性蛋白酶酶解時間3 h、加酶量4 000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解pH 4.0的條件下，料液比對抑菌活性的影響如圖4所示。

圖4 料液比對抑菌效果的影響Fig.4 Effect of liquid-liquid ratio on antibacterial effect

料液比在1∶4～1∶9(g∶mL)區(qū)間，隨著蒸餾水體積的增加，酶解液中暗色肉比例降低，酶解產(chǎn)物的抑菌活性整體呈下降趨勢，在1∶5～1∶4(g∶mL)區(qū)間，酶解產(chǎn)物的抑菌活性有所增加，但差異性不顯著(P>0.05)?？赡苁前瞪獗壤礁撸附庑Ч胶?，得到有抑菌活性的多肽數(shù)量越多。但隨著暗色肉比例繼續(xù)增加，與暗色肉結(jié)合的酶添加量一定，導(dǎo)致酶解效率達(dá)到極限，造成抑菌效果上升不顯著(P>0.05)，且暗色肉比例增多反而會影響蛋白酶與其的結(jié)合[26]，因此試驗(yàn)確定最適暗色肉比蒸餾水的料液比為1∶5(g∶mL)。

2.2.2 pH值對抑菌活性的影響

在酸性蛋白酶酶解時間3 h、加酶量4 000 U/g、酶解溫度50 ℃、料液比為1∶5(g∶mL)的條件下，pH對抑菌活性的影響如圖5所示，隨著pH值的增加，對致病菌的抑菌效果呈先上升后下降的趨勢，在pH值為4.5時抑菌率達(dá)到最大值。可能是酶解pH低于酸性蛋白酶的最適pH值時，隨著pH值的升高，酶活性也逐漸升高，得到的抗菌肽片段隨之增加[27]，從而抑菌率升高，但高于最適pH時，酶的活性降低，進(jìn)而影響酶解液的抑菌效果。根據(jù)單因素差異性分析，確定酸性蛋白酶酶解pH 4、4.5、5作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

圖5 pH對抑菌效果的影響Fig.5 Effect of pH on bacteriostatic effect

2.2.3 加酶量對抑菌活性的影響

在酸性蛋白酶酶解時間3 h、酶解pH 4.0、酶解溫度50 ℃、料液比為1∶5(g∶mL)的條件下，加酶量對抑菌活性的影響由圖6所示。

圖6 加酶量對抑菌效果的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on antibacterial effect

隨著加酶量的增多，對大腸桿菌的抑菌效果呈先上升后下降的趨勢，加酶量在3 000 U/g時抑菌活性最大。原因可能是加酶量在2 000～3 000 U/g時，隨著酶數(shù)量的增加，酶解效果越好，得到的能夠有效抑菌的酶解產(chǎn)物越多。當(dāng)加酶量達(dá)到一定值時，過多的酶將具有抑菌作用的肽片段進(jìn)一步水解成沒有抑菌活性的更小片段，進(jìn)而使酶解液抑菌率降低。根據(jù)單因素差異性分析，確定最適加酶量2 000、3 000、4 000 U/g作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

2.2.4 酶解時間對抑菌活性的影響

在酸性蛋白酶酶解pH 4.0、加酶量4 000 U/g、酶解溫度50 ℃、料液比為1∶5(g∶mL)的條件下，酶解時間對抑菌活性的影響如圖7所示，隨著酶解時間的進(jìn)行，對大腸桿菌的抑菌率呈先上升后逐漸下降,然后趨于穩(wěn)定的趨勢?？赡茉诿附馇捌?，酸性蛋白酶能夠快速水解底物得到大量具有抗菌性的酶解產(chǎn)物，所以酶解液的抑菌率不斷上升，但隨著酶解的繼續(xù)進(jìn)行，具有抑菌活性的肽片段被蛋白酶進(jìn)一步水解，成為無抑菌活性或更小抑菌活性的肽片段，所以在酶解后期，酶解液抑菌率逐漸降低。為選擇最適的酶解時間，選擇酶解時間2、3、4 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

圖7 酶解時間對抑菌效果的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis time on bacteriostatic effect

2.2.5 酶解溫度對抑菌活性的影響

在酸性蛋白酶酶解pH 4.0、加酶量4 000 U/g、酶解3 h、料液比為1∶5(g∶mL)的條件下，酶解溫度對抑菌活性的影響如圖8所示。

圖8 酶解溫度對抑菌效果的影響Fig.8 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on antibacterial effect

隨著酶解溫度的升高，對大腸桿菌的抑菌效果先上升后下降，溫度為50 ℃時，抑菌率最高，可能是蛋白酶的最適溫度為50 ℃，當(dāng)酶解溫度低于50 ℃時，隨著溫度的升高，酶活性隨之升高，酶解效率升高，酶解產(chǎn)物增多，酶解液抑菌率增加，但當(dāng)酶解溫度高于最適溫度50 ℃時，蛋白酶的活性受到抑制，隨著溫度的繼續(xù)增加，蛋白酶甚至變性失活，導(dǎo)致酶解效率低，酶解液抗菌活性也隨之降低。因此選擇酶解溫度45、50、55 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。

2.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化酶解條件

為研究酶解條件和抑菌率之間的關(guān)系，優(yōu)化獲得最佳酶解條件，根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素的響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 3 Box-Benhnken test design and response

利用方差分析可以得到各個數(shù)據(jù)之間的顯著差異。運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件對各個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行最小二乘法擬合回歸，得到的二次多元回歸模型方程為：Y=+60.95+4.62A-2.05B-2.00C-1.51D+4.20AB+0.15AC-0.43AD+1.38BC+1.63BD+12.73CD+5.68A2+4.69B2-0.18C2+0.29D2。經(jīng)響應(yīng)面分析，模型計(jì)算得到最佳酶解理論條件為：酶解pH為4.0、加酶量為2 015.54 U/g，酶解時間為2.45 h，溫度為45.18 ℃，對大腸桿菌的抑菌率理論值為83.97%。結(jié)合實(shí)際條件，最終選擇料液比1∶5(g∶mL)、pH 4.0、加酶量2 000.0 U/g，時間2.50 h,溫度45 ℃為最優(yōu)條件，該條件下，實(shí)際測得抑菌率值為(79.56±1.56)%，與理論值相比，相對誤差為(4.41±1.56)%。

2.3 鰹魚暗色肉抗菌粗肽分離純化

2.3.1 超濾結(jié)果分析

一般情況下，抗菌肽是一類分子量相對較小的物質(zhì)，需對其進(jìn)行多步分離。首先通過高速離心、沉淀法或超濾法對粗肽進(jìn)行初步分離，目的是去除樣品中分子量較大的脂肪以及其他大顆粒物，再通過離子交換層析、蛋白凝膠層析、電泳凝膠及高效液相對其進(jìn)行深一度的分離純化。如樊陳等[28]對地衣芽孢桿菌產(chǎn)抗菌肽進(jìn)行純化時，首先將地衣芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行初步離心超濾濃縮后，接著進(jìn)行陰離子交換層析，冷凍干燥后，再進(jìn)行凝膠層析，最后經(jīng)反相高效液相分離純化獲得抗菌肽。

超濾離心法主要以分子量的大小、密度、形狀進(jìn)行分離[29-30]。經(jīng)截留分子量分別為5、10 kDa的超濾膜對樣液進(jìn)行超濾離心初步分離后，分別得到大于10 kDa、5～10 kDa、小于5 kDa三種組分。對得到的3種組分分別進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果如圖9所示。

圖9 酸性蛋白酶水解物超濾離心后3種組分的抑菌作用比較Fig.9 Comparison of antibacterial activity of three components after ultrafiltration of acid protease hydrolysate注：Ⅰ代表大于10 kDa的組分；Ⅱ代表5～10 kDa的組分；Ⅲ代表小于5 kDa的組分

Ⅰ組分中對試驗(yàn)菌均沒有抑菌性，Ⅱ組分中對大腸桿菌、希瓦氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為(56.44±3.80)%、(36.75±3.31)%、(27.67±3.73)%、(37.45±0.97)%。Ⅲ組分中對大腸桿菌、希瓦氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為(86.36±2.29)%、(57.89±4.39)%、(44.89±1.84)%、(67.66±2.85)%。經(jīng)比較Ⅱ、Ⅲ組分均有抑菌效果，Ⅲ組分的抑菌效果最好?？赡苁怯捎诳咕牡姆肿恿恳话爿^小，通常只有12～50個氨基酸[31-32]。將Ⅱ、Ⅲ組分合并收集，進(jìn)行下一步的Sephacryl S-100 HR凝膠層析分離。

2.3.2 凝膠色譜結(jié)果分析

凝膠層析是按照蛋白質(zhì)的分子量大小進(jìn)行的分離技術(shù)。不同類型的凝膠篩孔大小不同，大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠珠之間的縫隙先被洗脫下來，但小分子受其運(yùn)動路程長和來自凝膠珠內(nèi)部的阻力的影響，從柱子上洗脫下來所花費(fèi)的時間較長。通過Sephacryl S-100 HR分離純化的蛋白質(zhì)和多肽分子量范圍為1～100 kDa。如圖10所示,超濾后的暗色肉抗菌肽經(jīng)凝膠Sephacryl S-100層析純化后，共有4個峰，分別為S-1、S-2、S-3和S-4。

圖10 超濾后酶水解物的凝膠層析Fig.10 Gel chromatography of enzymatic hydrolyzate after ultrafiltration

將冷凍干燥后的各個組分配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的樣液，進(jìn)行抑菌試驗(yàn),效果如圖11所示。

S-1、S-2組分對試驗(yàn)菌均沒有抑菌性，S-3組分對大腸桿菌、希瓦氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為(96.71±3.0)%、(77.89±2.09)%、(64.89±1.24)%、(88.66±5.39)%。S-4組分中對大腸桿菌、希瓦氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為(36.44±4.21)%、(14.54±3.01)%、(7.67±3.64)%、(14.56±3.10)%。S-1、S-2組分無抑菌性可能是由于凝膠層析初期，首先被洗脫下來的大分子物質(zhì)無抑菌性。S-4較S-3組分抑菌效果要弱的多，可能是由于酸性蛋白酶水解后期，使得具有抑菌活性的氨基酸序列的多肽進(jìn)一步水解。S-3組分的抑菌性要高于超濾后的組分Ⅲ，由此可以粗略得出凝膠層析可以進(jìn)一步對抗菌肽進(jìn)行分離純化。

圖11 酶水解物凝膠層析后各組分抑菌率的比較Fig.11 Comparison of antibacterial rate of each component after ultrafiltration of enzymatic hydrolyzate gel chromatography

2.3 S-3抗菌肽對測試菌種的MIC值

抗菌肽對不同菌種的最小抑菌濃度有一定差異。從表4可以得出，暗色肉抗菌肽S-3對大腸桿菌的MIC值為40 μg/mL，對金黃色葡萄球菌和希瓦氏菌的MIC值為80 μg/mL，對枯草芽孢桿菌的MIC值為160 μg/mL。

表4 S-3抗菌肽對測試菌種的MIC值Table 4 MIC value of antibacterial peptide against test strain

注：“+”表示與陰性、陽性對照組對照后酶標(biāo)板孔底部有白色沉淀；“-”表示與陰性、陽性對照組對照后酶標(biāo)板孔底部無白色沉淀。

有些因素可能會影響致病菌的MIC值，已有研究表明致病菌可以通過改變細(xì)胞壁和膜表面電荷[33-34]來隔離和排斥抗菌肽[35-36]，導(dǎo)致MIC值增大。此外，孫宜君[37]對螺旋藻抗菌肽的純化鑒定及其抑菌機(jī)理的研究表明，K+、Ca2+等離子存在也會影響微生物的MIC值。

3 小結(jié)

以鰹魚暗色肉為原料，選擇酸性蛋白酶，以料液比為1∶5(g∶mL)、酶解pH為4.0、加酶量為2 000.0 U/g，酶解2.5 h，酶解溫度為45 ℃，得到的多肽對大腸桿菌具有較好的抑菌效果，實(shí)際抑菌率為(79.56±1.56)%。通過對鰹魚暗色肉的優(yōu)化產(chǎn)物抗菌粗肽進(jìn)行超濾分離、凝膠層析分離純化，獲得一組分離峰S-3,對其進(jìn)行最小抑菌濃度的測定，其中對大腸桿菌的MIC值為40 μg/mL，對金黃色葡萄球菌和希瓦氏菌的MIC值為80 μg/mL，對枯草芽孢桿菌的MIC值為160 μg/mL。希望該研究對制備用于革蘭氏陰性細(xì)菌或廣譜抗菌性的海洋魚類抗菌肽提供指導(dǎo)，同時也為海洋經(jīng)濟(jì)魚類高值化研究提供新的思路。