鄧 波, 王維維, 張小濤, 童福強, 姬厚偉, 劉與銘, 張 麗

(貴州中煙工業(yè)有限公司技術中心, 貴州 貴陽 550009)

白肋煙是混合型卷煙的重要原料,未經處理的白肋煙含糖量低,煙堿和總氮含量高,吸味品質表現(xiàn)為具有白肋煙特征香氣,但余味較差,刺激性和勁頭較大,地方性雜氣和氨氣較重[1-3]。白肋煙處理工藝是影響混合型卷煙品質的關鍵因素之一,主要包括重加里料和高溫烘焙[4]。重加里料主要用來彌補白肋煙自身含糖量的不足,進而達到降低煙氣pH、協(xié)調煙氣和增加香味的作用[5];高溫烘焙則有助于料液與煙葉化學成分發(fā)生焦糖化作用和美拉德反應等,產生香味物質,提高卷煙的吸食品質,且有助于減少地方性雜氣、減輕刺激性和改善余味[6]。國內外對白肋煙處理工藝研究較多,主要是通過控制加料含水率、烘焙溫濕度、烘焙時間、干燥終端含水率等工藝參數來控制白肋煙的處理質量,工藝參數的確定主要依賴于處理后白肋煙的評吸結果[7,8],評吸結果主觀性強、易受評吸人員狀態(tài)及環(huán)境影響。深入研究烘焙前后白肋煙香氣成分的變化規(guī)律可為白肋煙工藝參數優(yōu)化及白肋煙處理效果評價提供客觀、可靠的支撐,找到適合國內白肋煙處理的最優(yōu)工藝參數,進而提高混合型卷煙產品質量。

固相微萃取(SPME)具有無需前處理、樣品用量少、選擇性強、靈敏度高等優(yōu)點,常與GC/MS聯(lián)用測定揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分[9,10],被廣泛用于食品[11-14]、生物[15-17]、醫(yī)學[18,19]、環(huán)境[20-22]等領域。本文采用頂空固相微萃取-氣相色譜/質譜法(HS-SPME-GC/MS)技術對白肋煙中的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分進行測定,并采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)比較白肋煙烘焙前后化學成分的變化,為白肋煙烘焙效果的評價和白肋煙烘焙參數的優(yōu)化提供有效的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CP224S型電子分析天平(感量0.000 1 g,德國Sartorius公司);配有TriPlus RSHTM自動進樣器的Thermo Trace1310-ISQ GC-MS氣相色譜/質譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。固相微萃取纖維頭:活性炭/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS),膜厚85 μm;二乙烯基苯/活性炭/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS),膜厚50/30 μm;聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB),膜厚65 μm;聚乙二醇(PEG),膜厚60 μm;聚丙烯酸酯(PA),膜厚85 μm(美國Supelco公司)。

乙酸苯乙酯(純度99%)和79種標樣(純度均≥97%)(北京J&K公司);丙酮(色譜純,美國TEDIA公司)。

2批次白肋煙煙葉處理過程中烘焙入口和烘焙出口各取3個樣本,每個樣本重復測定2次(B-1-1～B-1-6、B-2-1～B-2-6為烘焙入口樣品,A-1-1～A-1-6、A-2-1～A-2-6為烘焙出口樣品),所有樣品研磨成粉后過40目篩,并保存于4 ℃冰箱。

1.2 SPME條件

準確稱取0.020 0 g煙粉裝入20 mL頂空瓶中,加入1 μL 20 μg/mL乙酸苯乙酯和氘代苯酚的丙酮溶液(內標),然后蓋上磁性頂空瓶蓋待測。

固相微萃取纖維頭:65 μm PDMS/DVB;孵化溫度:60 ℃,孵化時間:8 min,萃取時間:40 min;解吸溫度:250 ℃;解吸時間:3 min;老化時間:30 min。

1.3 頂空條件

準確稱取1.000 0 g煙粉樣品裝入20 mL頂空瓶中,加入1 μL 20 μg/mL乙酸苯乙酯和氘代苯酚的丙酮溶液(內標),然后蓋上磁性頂空瓶蓋待測。

樣品平衡溫度:80 ℃;樣品平衡時間:40 min;進樣方式:加壓恒時;進樣壓力:130 kPa;進樣時間:0.5 min。

1.4 GC-MS條件

色譜柱:DB-WAXETR毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:高純He,純度99.999%;流速:1.0 mL/min;進樣口溫度:250 ℃;進樣模式:不分流進樣;升溫程序:40 ℃保持2 min,以4 ℃/min的速度升至200 ℃,保持1 min,然后以10 ℃/min的速度升至240 ℃,保持10 min。

離子源:電子轟擊(EI);電子能量:70 eV;離子源溫度:280 ℃;傳輸線溫度:240 ℃;質量分析器:四極桿;掃描模式:SIM+SCAN; SCAN質量掃描范圍:29～400 amu。

1.5 數據分析

利用自動質譜圖解卷積和鑒定系統(tǒng)(AMDIS)對共流出色譜峰進行解卷積,利用Xcalibur軟件的processing setup編輯自動積分方法,然后利用Quan Browser功能對自動積分結果進行手動校正,生成一個包含樣品信息、保留時間和相對峰面積(峰面積與內標峰面積比值)的三維矩陣。

應用SIMCA-P14.0軟件(瑞士Umetrics公司)對數據進行標準化處理后,進行PCA、PLS-DA等化學計量學分析。應用SPSS19.0軟件(美國IBM公司)對差異物進行t-檢驗。應用Multi Experiment Viewer軟件(v 4.8.1)進行熱圖繪制。

圖1 HS-GC/MS和HS-SPME-GC/MS方法分析白肋煙中揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的總離子流圖

2 結果與討論

2.1 分析模式的選擇

HS和HS-SPME是測定揮發(fā)性成分的常用方法[23]。比較了HS和HS-SPME方法測定煙葉中揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的定性結果。結果表明,HS-SPME在測定煙葉揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分種類方面具有明顯優(yōu)勢(見圖1)。由于HS無富集作用、靈敏度低,測定的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分非常有限,僅測到乙醛、2-甲基丙醛、丙酮、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、乙酸、丙二醇、煙堿、新植二烯、1,2-二乙酸甘油酯、麥斯明和二烯煙堿,且響應值相對較低。與HS-SPME方法相比,HS方法在測定乙醛、2-甲基丙醛等低沸點(100 ℃以下)成分時有利,但不能測定巨豆三烯酮、紫羅蘭酮、5-羥甲基糠醛等高沸點的煙草特征香味成分,及吡啶、糠醛、丁內酯、苯乙酮等煙草中微量的香味成分。

2.2 固相微萃取條件的優(yōu)化

2.2.1固相微萃取纖維頭的選擇

不同材質的萃取頭對不同化合物的萃取效率不同。在萃取溫度60 ℃,孵化時間8 min,萃取時間40 min, 250 ℃解吸3 min條件下,比較了85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、60 μm PEG和85 μm PA 5種不同纖維頭對煙粉中揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的萃取效果(見表1)。結果表明:85 μm CAR/PDMS可以得到104個峰,其中致香成分64種;50/30 μm DVB/CAR/PDMS可以得到91個峰,其中致香成分64種;65 μm PDMS/DVB可以得到110個峰,其中致香成分78種;60 μm PEG可以得到78個峰,其中致香成分42種;85 μm PA可以得到86個峰,其中致香成分60種。由于60 μm PEG和85 μm PA極性較強,得到的色譜峰數目和致香成分數均小于其他3種纖維頭,為了保證分析數據的全面性,不采用60 μm PEG和85 μm PA這兩種纖維頭。

表1 不同萃取纖維頭條件下得到的色譜峰個數和致香成分數

CAR: carboxen; PDMS: polydimethylsiloxane; DVB: divinylbenzene; PEG: polyethylene glycol; PA: polyacrylate.

除了分析化合物的豐富性,分析精密度也是評價纖維頭的一個主要因素。對85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB 3種纖維頭共有的86個色譜峰的分析精密度進行了比較,結果如表2所示。3種纖維頭中,50/30 μm DVB/CAR/PDMS的分析精密度最差,65 μm PDMS/DVB比85 μm CAR/PDMS的分析精密度更好,且測定的香味成分種類更多。因此選擇65 μm PDMS/DVB。

表2 不同纖維頭的分析精密度

RSD: relative standard deviation of the peak areas for a component in six repeated measurements using the same fiber.

2.2.2萃取溫度優(yōu)化

在孵化時間為8 min、萃取時間為40 min、250 ℃解吸3 min條件下,分別考察了40、50、60、70和80 ℃時各色譜峰的相對峰面積。以5種不同極性、不同沸點的重要香味成分為例(下同),各色譜峰在不同溫度條件下的相對峰面積變化如圖2a所示。隨溫度升高,糠醛、茄酮相對峰面積依次升高;丙酸相對峰面積依次降低;苯酚、D-泛酰內酯相對峰面積先升高后降低。該結果可能與溫度的動力學和熱力學作用有關,溫度升高有利于揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分進入頂空相,同時不利于纖維頭對揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的吸附。低沸點極性化合物在低溫下即可達到氣固平衡,而升高溫度將降低其在纖維頭上的吸附,因此響應出現(xiàn)下降趨勢。而升高溫度有利于高沸點化合物的揮發(fā),響應升高[24]。為保證分析方法的全面性和靈敏度,選擇萃取溫度為60 ℃。

圖2 萃取溫度(a)、孵化時間(b)、萃取時間(c)和解吸時間(d)對白肋煙中5種重要成分相對峰面積的影響

2.2.3孵化時間的優(yōu)化

在萃取前,需將樣品在一定溫度條件下孵化一段時間。在萃取溫度為60 ℃、萃取時間為40 min、250 ℃解吸3 min條件下,分別考察了孵化2、4、6、8和10 min時各色譜峰的相對峰面積,如圖2b所示。結果表明:隨孵化時間延長,各色譜峰相對峰面積略有增加;孵化8 min時,糠醛、D-泛酰內酯、苯酚相對峰面積增加,茄酮和丙酸相對峰面積下降。為保證分析方法的全面性和靈敏度,選擇孵化時間8 min。

2.2.4萃取時間的優(yōu)化

在萃取溫度為60 ℃、孵化時間為8 min、250 ℃解析3 min條件下,分別考察了萃取10、20、30、40、50、60、70、80和90 min時各色譜峰的相對峰面積,如圖2c所示。隨萃取時間延長,糠醛、茄酮、丙酸的相對峰面積先上升后趨于穩(wěn)定;苯酚和D-泛酰內酯相對峰面積先上升,40 min后下降。因此,萃取時間選擇40 min。

2.2.5解吸時間的優(yōu)化

為保證各組分解吸完全,在孵化時間8 min、60 ℃萃取40 min、解吸溫度250 ℃條件下,分別考察了解吸時間1、2、3、4、5和6 min時各色譜峰的相對峰面積。結果如圖2d所示,解吸時間為3 min時,色譜峰相對峰面積趨于穩(wěn)定。因此選擇解吸時間3 min。

2.3 實驗方法評價

2.3.1定性結果

取等量的烘焙前后煙粉樣品,充分混合得到質控(QC)樣品。采用建立的HS-SPME-GC/MS方法對QC樣品進行檢測。利用AMDIS對共流出色譜峰進行解析,單次分析檢測172個色譜峰。通過與標準品(79種吡啶類、吡嗪類、酸類、酯類、酮類、生物堿、醇類、烷烴)的保留時間和質譜圖嚴格對照,并運用美國國家標準與技術研究院(NIST)標準質譜庫進行檢索(反匹配度大于800),結合保留指數,初步定性了其中122種揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分(見表3)。檢測到的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分主要是一些香味成分,包括吡啶類、吡嗪類、烯烴類、醛類、酮類、酯類、酸類、醇類、酚類等。

表3 白肋煙中鑒定到的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分

表3 (續(xù))

Rt: retention time; RI: retention index; R.match: the matching degree of the actual mass spectrum to the standard mass spectrum in National Institute of Standards and Technology.* The compound was identified by comparing the retention time and mass spectrum with standard.The ions in bold were quantitative ions.

2.3.2方法精密度

在化學計量學分析中,目標物分析的精密度影響分析結果。連續(xù)5天,每天平行測定3個QC樣品,對實驗方法的精密度進行了考察。所有檢測峰的保留時間的相對偏差均在±0.04 min內,其保留時間的穩(wěn)定性為自動積分提供了可能。檢測到的122種化合物中,93種化合物的相對峰面積的RSD在15%以內,占總峰個數的76%,占總峰面積的95%(見圖3)。

2.4 白肋煙烘焙前后揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的變化

2.4.1PCA分析

為初步了解不同批次烘焙入口與烘焙出口煙葉的相似性和差異性,采用無監(jiān)督模式的PCA方法對2個批次白肋煙烘焙前后數據進行分析。在圖4的PCA得分圖中,第2批次烘焙前后白肋煙煙葉樣品在第一主成分(PC1)維度上區(qū)分明顯,PC1代表了樣本總體差異的42.6%,第1批次樣品烘焙前后差異不明顯,但可區(qū)分。兩批次白肋煙煙葉樣品在第二主成分(PC2)維度上區(qū)分明顯,PC2代表了樣本總體差異的27.1%。

圖3 不同化合物的日間相對標準偏差的分布

2.4.2PLS-DA分析

圖5 烘焙前后白肋煙煙葉的PLS-DA分析

圖4 烘焙前(A-1、A-2)、后(B-1、B-2)白肋煙煙葉主成分得分圖

為進一步了解白肋煙煙葉烘焙前后揮發(fā)性、半揮發(fā)性化學成分的差異,將烘焙入口樣品作為一組(B-1-1～B-1-6、B-2-1～B-2-6),烘焙出口樣品作為一組(A-1-1～A-1-6、A-2-1～A-2-6),建立PLS-DA模型。PLS-DA是一種有監(jiān)督分析方法,用于建立類別間的數學模型,使各類樣品間達到最大的分離,并可根據變量重要性投影(VIP)值篩選差異化合物。圖5a的得分圖中,烘焙前后白肋煙煙葉在PC1維度上區(qū)分明顯,PC1代表了樣本總體差異的41.1%,且烘焙后的2批次樣品在PC2維度上區(qū)分明顯,PC2代表了樣本總體差異的18.6%。建立的PLS-DA模型2個主成分解釋了96.1%的Y變量差異,預測能力為94.6%,說明該模型具有較好的預測能力[25]。經過200次排列檢驗得到的R2、Q2截距分別為0.204和-0.333(見圖5b),R2截距小于0.4,Q2截距小于0.05,表明該模型穩(wěn)定可靠,不存在過擬合。

圖6 烘焙前后白肋煙煙葉中揮發(fā)性、半揮發(fā)性化合物的熱圖

根據建立的PLS-DA模型的VIP值(閾值為1),初步篩選了32種對區(qū)分烘焙前后煙葉貢獻大的成分(見圖5c)。為更直觀地了解白肋煙烘焙前后化學成分的變化,采用32種化學成分對2批次烘焙前后白肋煙煙葉進行聚類分析,并繪制熱圖(見圖6)。結果表明:煙葉樣品按照烘焙前和烘焙后明顯聚為2大類,烘焙前和烘焙后煙葉又可分別按批次分為2小類,即烘焙前后煙葉可采用差異顯著的32種化學成分進行區(qū)分。對2個批次煙葉烘焙前后的32種成分分別進行t-檢驗,除3-乙?；?1H-吡咯、1,3,7,7-四甲基-2-氧雜雙環(huán)[4.4.0]-5-葵烯-9-酮在第1批次烘焙前后煙葉間無顯著性差異,苯甲酸、乙基香蘭素和香蘭素在第2批次烘焙前后煙葉間無顯著性差異外,其余27種成分在2個批次煙葉樣品烘焙前后均存在顯著性差異(p<0.05)。烘焙后,2批次白肋煙煙葉中甘油、丙二醇、3-乙基-2-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮、2-乙?；拎?、三甲基吡嗪、異氟爾酮、茶香酮、薄荷醇、乙基吡嗪、2,5-二甲基吡啶、異戊酸、丁內酯、苯乙醇、2,3-丁二醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、2-甲基丁酸、2,3-二甲基吡嗪、γ-己內酯、2-甲基吡啶含量均顯著下降;6-乙基-5,6-二氫-2H-吡喃-2-酮、2-吡咯烷酮、吲哚、巴豆酸、3-乙基-4-甲基-1H-吡咯-2,5-二酮、5-羥甲基糠醛、麥芽酚和二烯煙堿含量均顯著上升。

與烘焙前相比,烘焙后白肋煙煙葉中的大部分揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分含量下降,主要與揮發(fā)有關,此過程也有利于除去2-乙?；拎さ炔焕跓煔飧泄俚奈镔|[26]。另外,烘焙后部分吡咯類、酸類、呋喃類等煙草特征香味成分含量顯著上升。吡咯類具有咖啡、可可的香韻,可增加白肋煙煙香;吲哚為色氨酸的分解產物,具有梔子花的香氣;巴豆酸含量增高可能與長鏈脂肪酸的分解和焦糖化反應有關;5-羥甲基糠醛為重要的煙草致香物質,具有甜的花香,與碳水化合物的分解及美拉德反應有關[27,28]。麥芽酚可能為料液中成分,高溫烘焙有助于料液的吸收。綜上所述,高溫烘焙則有助于料液吸收,促進料液與煙葉化學成分發(fā)生焦糖化作用和美拉德反應產生香味物質,提高白肋煙煙葉的吸食品質。

3 結論

建立了HS-SPME-GC/MS測定煙葉中揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的方法。該方法樣品用量小、前處理簡單、靈敏度高,適用于煙葉中低含量的揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的測定。同時結合化學計量學方法分析了白肋煙烘焙前后化學成分的變化,為白肋煙烘焙條件的優(yōu)化提供了科學的檢測方法。揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的非靶向分析方法可較為全面、系統(tǒng)地表征氣味物質,與化學計量學結合可直觀反映氣味物質的變化,篩查關鍵的風味物質基礎,在茶葉、面包等食品加工領域具有廣泛的應用推廣前景。