何嘉雯, 溫家欣, 賴宇紅, 劉亞雄, 曹雅靜, 陳 俏

(廣東省藥品檢驗(yàn)所, 廣東 廣州 510180)

酵素及酵素食品來自日本天然健康的食品概念,國(guó)內(nèi)引用其調(diào)節(jié)新陳代謝的功能,宣稱酵素食品具有通便減肥的功效[1,2]。網(wǎng)絡(luò)上酵素食品主要有果凍、糖果、蜜餞和飲料等,經(jīng)發(fā)展已成為新興的暢銷減肥產(chǎn)品。由于市場(chǎng)利潤(rùn)巨大,減肥類非法添加藥物層出不窮[3-10]。2019年初,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)宣稱通便減肥的酵素食品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè),檢出一種減肥類非添新成分,經(jīng)確證為“匹可硫酸鈉”。

匹可硫酸鈉(sodium picosulfate)CAS號(hào)10040-45-6,別名匹克硫酸鈉,相對(duì)分子質(zhì)量481.41,分子式C18H13NNa2O8S2,結(jié)構(gòu)式見圖1,白色或幾乎白色結(jié)晶粉末,無嗅無味,易溶于水、微溶于甲醇[11,12]。匹可硫酸鈉是一種緩瀉藥,可用于各種形態(tài)的便秘,不良反應(yīng)包括惡心、下痢、腸胃道反應(yīng)等[13,14]。匹可硫酸鈉及其制劑已在歐美、日本批準(zhǔn)使用,復(fù)方匹可硫酸鈉顆粒于2018年10月在國(guó)內(nèi)獲批,歸屬化學(xué)藥物管理。我國(guó)食品添加劑目錄、新資源食品名單均未收入匹可硫酸鈉,因此不能作為食品原料使用。匹可硫酸鈉在國(guó)內(nèi)認(rèn)知程度較低,有可能成為新型的減肥類非法添加藥物。

圖1 匹可硫酸鈉分子結(jié)構(gòu)圖

目前,減肥類非法添加藥物的檢測(cè)研究較多[3-10],以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為主流,檢測(cè)成分已達(dá)幾十種,但均未包含匹可硫酸鈉。關(guān)于果凍、軟糖、蜜餞基質(zhì)的研究較少,而食品中匹可硫酸鈉的檢測(cè)方法基本處于空白。減肥類藥物多為脂溶性成分,前處理基本采用甲醇[4-10]、乙腈[3]對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單提取。匹可硫酸鈉為鈉鹽,水溶性極佳,脂溶性差,采用有機(jī)溶劑提取高蛋白基質(zhì)時(shí)會(huì)被包埋而影響提取。本實(shí)驗(yàn)室曾以文獻(xiàn)方法[3,10]測(cè)定奶昔中的匹可硫酸鈉,回收率低于20%,不符合定量要求。另一方面,針對(duì)片劑、膠囊劑的前處理方法不適用于果凍、軟糖。匹可硫酸鈉在果凍、軟糖中的添加過程,可能是配成水溶液與溫?zé)岬墓麅鲆骸⑻且夯旌?再冷卻成型,因此匹可硫酸鈉可分散于食品內(nèi)部。樣品的有效溶散是提取關(guān)鍵,而有機(jī)溶劑對(duì)樣品中的食用膠有變性作用[15,16],不利于溶散過程。因此,檢測(cè)高蛋白、膠質(zhì)型酵素食品中匹可硫酸鈉,必須建立新的前處理方法。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)市場(chǎng)上酵素食品的摸查結(jié)果表明,近四成產(chǎn)品檢出匹可硫酸鈉,非法添加情況十分嚴(yán)峻。本文針對(duì)匹可硫酸鈉,開發(fā)了一種適用于果凍、軟糖、蜜餞、固體飲料等酵素食品的檢測(cè)方法,彌補(bǔ)當(dāng)前檢測(cè)方法的空白,為監(jiān)管提供技術(shù)支撐手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20ADXR高效液相色譜儀(日本島津公司); Triple Quad 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配ESI)(美國(guó)Sciex公司);渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司);恒溫水浴箱(德國(guó)Julabo公司);超聲提取器(昆山市超聲儀器有限公司);固相萃取裝置(美瑞泰克科技有限公司);超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)

匹可硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(純度96%,加拿大TRC公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)Holly公司);乙酸銨、氨水(含量25%～28%)、無水乙醇、三氯乙酸(分析純,廣州化學(xué)試劑廠);聚酰胺柱(1 000 mg/6 mL,美國(guó)Thermo公司)。氨水-70%乙醇混合溶液:量取100 mL氨水與900 mL 70%(v/v)乙醇水溶液混勻。1%三氯乙酸溶液:稱取10 g三氯乙酸溶于1 000 mL水中。

152批次酵素食品收集于風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)任務(wù)、飛行檢查和科研網(wǎng)購。提取考察實(shí)驗(yàn)用樣品采用陰性樣配制,均一化稱量后,果凍、軟糖高溫熔融時(shí)加入少量標(biāo)液,放冷備用;蜜餞、固體飲料加入少量標(biāo)液,放置半小時(shí)后備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg匹可硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品,用水配成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃下保存3個(gè)月。準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用水配成5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液,4 ℃下保存2周。取適量標(biāo)準(zhǔn)使用液,用水配成匹可硫酸鈉質(zhì)量濃度為5～500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,臨用新配。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

取適量樣品,采用搗碎、剪碎、研磨等方式充分粉碎或混合均勻后備用。

果凍、軟糖:準(zhǔn)確稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入40 mL水,80 ℃下水浴至樣品溶解,取出放冷至室溫,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶,用5 mL水洗滌離心管,洗滌液并入同一容量瓶,加入5 mL 1%三氯乙酸溶液,用水定容至50 mL,待凈化。

蜜餞:準(zhǔn)確稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入40 mL水,超聲提取20 min,提取液和殘?jiān)D(zhuǎn)移至50 mL比色管,用5 mL水洗滌離心管,洗滌液并入同一比色管,加入5 mL 1%三氯乙酸溶液,用水定容至50 mL,待凈化。

固體飲料:準(zhǔn)確稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入25 mL水,渦旋分散,80 ℃下水浴10 min,取出放冷至室溫,8 000 r/min下離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。加入20 mL水重復(fù)提取一次,合并兩次上清液。于上清液中加入5 mL 1%三氯乙酸溶液,用水定容至50 mL,待凈化。

若上述待凈化液渾濁,可取適量在8 000 r/min下離心5 min,取上清液備用。

1.3.2凈化

用10 mL水預(yù)先活化聚酰胺柱。取10 mL待凈化液于柱內(nèi),待凈化液流盡后,依次用10 mL水、10 mL 70%(v/v)甲醇水溶液洗滌,15 mL氨水-70%乙醇混合溶液洗脫,收集洗脫液于80 ℃下水浴蒸發(fā)至近干,用水定容至5 mL,過0.22 μm微孔濾膜,待測(cè)。若匹可硫酸鈉濃度超出線性范圍,可用水適當(dāng)稀釋。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱:Thermo Accucore RP-MS(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm,美國(guó)Thermo公司);流速:0.3 mL/min,乙腈-10 mmol/L乙酸銨(15∶85, v/v)等度洗脫。柱溫35 ℃,進(jìn)樣量5 μL。

采用ESI源,正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè);電噴霧電壓5 500 V,離子源溫度550 ℃;霧化氣壓力:3.447×105Pa,氣簾氣壓力2.759×105Pa,碰撞氣壓力6.207×104Pa。匹可硫酸鈉采集參數(shù):定量離子對(duì)m/z438.2/183.9,去簇電壓(DP)120 V,碰撞能(CE)40 V;定性離子對(duì)m/z438.2/278.2, DP 120 V, CE 28 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 匹可硫酸鈉的確證

匹可硫酸鈉為新發(fā)現(xiàn)的非法添加成分,需進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。采用Q Exactive高分辨質(zhì)譜(美國(guó)Thermo公司)采集有證標(biāo)準(zhǔn)品和可疑樣品中匹可硫酸鈉色譜峰的質(zhì)譜信息。色譜圖中,可疑樣品檢出與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致的色譜峰;一級(jí)質(zhì)譜圖中,正離子模式下標(biāo)準(zhǔn)品母離子精確質(zhì)量數(shù)為438.030 15,樣品為438.030 18,兩者質(zhì)量偏差小于0.000 05;在二級(jí)圖譜中有3個(gè)相同的碎片離子。上述結(jié)果表明,兩者為同一物質(zhì),檢出成分確證為匹可硫酸鈉。

圖2 不同提取方法對(duì)各基質(zhì)中匹可硫酸鈉的提取效果

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑和提取方式

匹可硫酸鈉水溶性極好,宜采用水或與水混溶的溶劑提取,選取水、甲醇和乙腈進(jìn)行比對(duì)。參考果凍、蜜餞、固體飲料常用的提取方式[15-17],選擇水浴和超聲進(jìn)行比較。提取溶劑與提取方式相互組合,形成6種方式,考察對(duì)應(yīng)的提取效果,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明:(1)采用水-水浴提取時(shí),4種基質(zhì)的回收率均大于98%; (2)含有乙腈的組合對(duì)各種基質(zhì)提取均不理想;(3)甲醇對(duì)軟糖的提取較差;(4)果凍、軟糖、固體飲料采用水浴提取優(yōu)于超聲,蜜餞兩者提取的效果相當(dāng)。分析原因,甲醇、乙腈使軟糖變性、固體飲料結(jié)塊,導(dǎo)致目標(biāo)物包埋,不利于提取。常溫下軟糖、果凍溶解不完全,含淀粉、奶精的固體飲料呈稀糊狀,不利于目標(biāo)物分散。進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)現(xiàn),蜜餞在提取時(shí)已充分剪碎,被水浸泡存在吸水發(fā)脹問題,超聲較水浴的發(fā)脹程度小,所以蜜餞更適于采用超聲提取。

80 ℃是溶解果凍、軟糖常用的溫度。在該溫度下,果凍、軟糖在水中溶散,水稀釋了樣品中食用膠的濃度,即使恢復(fù)至常溫亦不會(huì)再次成膠[15,16]。上文制得的果凍、軟糖和固體飲料提取液在80 ℃下水浴1小時(shí),考察匹可硫酸鈉的熱穩(wěn)定性。對(duì)于質(zhì)量濃度為100 μg/L的加標(biāo)提取液,水浴前后測(cè)得的峰面積比值為0.98～1.03,可以認(rèn)為匹可硫酸鈉溶液在80 ℃下加熱1 h仍穩(wěn)定。

綜上,果凍、軟糖、固體飲料采用水-水浴提取,蜜餞采用水-超聲提取。

2.2.2蛋白沉淀劑的選擇

奶昔、代餐等固體飲料含大量蛋白,需加入沉淀劑除去。參考乳制品常用的蛋白沉淀劑[18-20],考察亞鐵氰化鉀-乙酸鋅、乙腈和三氯乙酸的效果。加入沉淀劑后,回收率依次為61%、19%和98%,三氯乙酸最佳。進(jìn)一步考察,三氯乙酸有調(diào)節(jié)溶液酸度的作用。各基質(zhì)提取液pH為2～7,加入一定量三氯乙酸溶液后,pH值穩(wěn)定在2～3,有利于后續(xù)凈化。因此,在提取液中加入三氯乙酸可起到沉淀蛋白和穩(wěn)定提取液pH值的作用。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

2.3.1吸附條件的優(yōu)化

果凍、軟糖的膠質(zhì)和蜜餞的鹽會(huì)在分析過程中堵塞色譜柱,污染質(zhì)譜,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,必須進(jìn)行凈化。提取液為水溶液,采用固相萃取較合適,選擇HLB、MCX、聚酰胺(PA)進(jìn)行考察。設(shè)定的吸附量參考收集到的陽性樣品中含量的最高值。當(dāng)樣品中匹可硫酸鈉的含量為4 000 mg/kg,取樣1 g、稀釋倍數(shù)50、上樣量為10 mL時(shí),吸附總量為800 μg。MCX吸附率約34%, HLB和PA吸附率約100%。但HLB對(duì)目標(biāo)物和雜質(zhì)的吸附能力相當(dāng),30%(v/v)甲醇水溶液淋洗時(shí)會(huì)發(fā)生共流出。PA對(duì)目標(biāo)物和雜質(zhì)的吸附有差異,在70%(v/v)甲醇水溶液淋洗下雜質(zhì)被洗出而匹可硫酸鈉仍被保留。因此,選擇PA作為吸附劑。

2.3.2洗脫條件的優(yōu)化

匹可硫酸鈉利用磺酸基,通過氫鍵與聚酰胺結(jié)合,在酸性和中性下暴露的磺酸基有利于吸附,堿性時(shí)氫鍵被破壞從而被洗脫,這是提取液pH 2～3有利于吸附的原因。依次用10 mL的水、30%(v/v,下同)甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液等溶劑進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明,上述中性溶液均不影響PA對(duì)匹可硫酸鈉的吸附,隨甲醇體積比的升高,洗脫雜質(zhì)的能力增強(qiáng)。因此,選擇水洗去水溶性雜質(zhì),70%甲醇水溶液洗去有機(jī)雜質(zhì)。

當(dāng)淋洗溶劑為堿性時(shí),PA對(duì)匹可硫酸鈉解吸附,依次用不同體積比(1∶99、5∶95、10∶90和20∶80)的氨水-70%乙醇混合溶液進(jìn)行解吸,洗脫體積分別為5、10、15和20 mL時(shí)的洗脫效果見圖3。結(jié)果表明,當(dāng)洗脫體積為15 mL時(shí),各溶液回收率均達(dá)到80%。氨水-70%乙醇混合溶液(10∶90, v/v)的回收率為97%,滿足實(shí)驗(yàn)要求。若洗脫液中氨水和乙醇的比例大,則直接測(cè)定時(shí)有明顯的溶劑效應(yīng),應(yīng)蒸發(fā)除去后用水復(fù)溶,獲得潔凈的樣品溶液。

需要注意,尼龍是聚酰胺纖維,不可使用尼龍濾膜過濾樣品溶液。經(jīng)考察,聚醚砜(PES)和聚四氟乙烯(PTFE)不吸附目標(biāo)物,均可使用。一般情況下,PES適用于水溶液,PTFE適用于水溶液和有機(jī)溶液。

圖3 不同洗脫液組成和用量對(duì)匹可硫酸鈉的洗脫效果

2.3.3色素的干擾考察

果凍、軟糖、蜜餞中使用的人工合成著色劑被本方法提取,但不能在凈化過程中除去,需考察色素共存的影響。在加標(biāo)提取液中加入檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)等常用色素,結(jié)果表明,1.0 g/kg色素共存時(shí),匹可硫酸鈉回收率達(dá)98%,不受影響。

2.4 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

美國(guó)藥典[12]采用乙腈-磷酸鹽緩沖液體系測(cè)定匹可硫酸鈉原料藥,此條件在液相色譜-質(zhì)譜上不適用,緩沖鹽用10 mmol/L乙酸銨替代。更換緩沖鹽后,色譜峰略有拖尾,但隨C18色譜柱填料粒徑的減小,柱效的提高使峰形大有改善。因此,采用100 mm×2.1 mm規(guī)格的亞三色譜柱,乙腈-10 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相。

文獻(xiàn)[21]采用正離子模式檢測(cè)匹可硫酸鈉及其代謝物,因此在正離子模式下優(yōu)化質(zhì)譜條件。用蠕動(dòng)泵以5 μL/min的流速連續(xù)注射100 μg/L的匹可硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液于ESI源中,進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜掃描,二級(jí)圖譜見圖4。選擇響應(yīng)強(qiáng)度高、基線噪音低的m/z438.2/183.9、438.2/278.2為監(jiān)測(cè)離子對(duì),并在MRM模式下優(yōu)化離子對(duì)的去簇電壓、碰撞能等參數(shù)。

圖4 匹可硫酸鈉的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.5 溶劑效應(yīng)

采用常用的有機(jī)溶劑甲醇、乙醇和乙腈,以有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)為0%、10%、20%、30%、40%、50%、70%和100%的混合水溶液,分別配制100 μg/L匹可硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液,考察溶劑效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)有機(jī)溶劑在30%或以下時(shí),匹可硫酸鈉的響應(yīng)值無明顯差異;當(dāng)有機(jī)溶劑高于30%時(shí),隨其體積分?jǐn)?shù)的增加,響應(yīng)值明顯下降。因此,上機(jī)溶劑的有機(jī)相需控制在30%以下,采用水配制標(biāo)準(zhǔn)溶液最佳。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)由基質(zhì)中共提取物干擾和目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電離所致。為評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng),本研究使用4種基質(zhì)的空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為5～500 μg/L的系列溶液,對(duì)質(zhì)量濃度與峰面積進(jìn)行線性回歸,將回歸方程斜率代入公式(基質(zhì)效應(yīng)=(1-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),負(fù)值表示基質(zhì)抑制,正值表示基質(zhì)增強(qiáng),絕對(duì)值越大則效應(yīng)越強(qiáng)[22]。果凍、軟糖、蜜餞和固體飲料的基質(zhì)效應(yīng)依次為-7.8%、-4.0%、-9.8%和-8.7%,屬于較弱的基質(zhì)抑制,可不采取手段進(jìn)行校正。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1線性范圍、線性方程和檢出限

用水分別配制質(zhì)量濃度為5、10、50、100、250、500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x, μg/L)進(jìn)行線性回歸,回歸方程為y=2 696.01x+1 994.60,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9。結(jié)果表明匹可硫酸鈉在5～500 μg/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

向陰性樣品中添加不同水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按取樣1 g,稀釋25倍計(jì)算,信噪比(S/N)≥3時(shí),匹可硫酸鈉質(zhì)量濃度為2 μg/L,方法檢出限為0.05 mg/kg;信噪比S/N≥10時(shí),匹可硫酸鈉質(zhì)量濃度為5 μg/L,方法定量限為0.125 mg/kg,可滿足非法添加檢驗(yàn)的要求。

2.7.2回收率和精密度

糖果、軟糖、蜜餞和固體飲料4種基質(zhì)差異較大,均需進(jìn)行考察。在各基質(zhì)中進(jìn)行1倍、2倍、10倍定量限3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平平行測(cè)試6次(n=6),結(jié)果見表1。匹可硫酸鈉在各基質(zhì)中的回收率為89.2%～111.8%,相對(duì)平均偏差(RSDs)為2.5%～10.4%,結(jié)果良好。

表1匹可硫酸鈉在各基質(zhì)中的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

Table1Spiked recoveries and RSDs of sodium picosulfate in different matrices(n=6)

MatrixSpiked/(mg/kg)Recovery/%RSD/%Jelly0.12597.78.30.2598.02.61.25111.82.5Gelcandy0.12591.68.60.25108.110.41.2599.59.7Preservedfruit0.125107.37.50.25107.53.21.25103.23.8Beveragepowder0.12589.25.60.2591.14.01.2594.25.1

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

按本方法測(cè)定酵素食品152批次,在58批次樣品中檢出匹可硫酸鈉,陽性率為38.2%,具體檢出情況見表2。匹可硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液及典型樣品提取定量離子流色譜圖見圖5。匹可硫酸鈉在果凍、軟糖、蜜餞和固體飲料中均有檢出,除去少數(shù)含量極低的樣品,各基質(zhì)中檢出含量的最低值和最高值相差4～20倍,含量波動(dòng)較大,安全風(fēng)險(xiǎn)較高。

表2 匹可硫酸鈉在各基質(zhì)的檢出批次數(shù)和檢出含量

圖5 匹可硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液及典型樣品提取定量離子流色譜圖

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定酵素食品中匹可硫酸鈉的方法。目標(biāo)物采用水作為提取溶劑,經(jīng)水浴或超聲提取,聚酰胺凈化。方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度滿足非法添加檢測(cè)要求,特別適合果凍、軟糖、蜜餞和固體飲料基質(zhì)酵素食品中匹可硫酸鈉的定性、定量分析,靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng),準(zhǔn)確可靠。該方法能彌補(bǔ)現(xiàn)時(shí)酵素食品中匹可硫酸鈉的檢測(cè)空白,有一定的實(shí)用意義。