林琳，孫霄，侯虎

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266003)

海參屬于棘皮動(dòng)物門，是一種重要的無脊椎動(dòng)物[1]。刺參(Stichopusjaponicus)是海參中比較知名的品種，在中國主要生長在北方地區(qū)的海域中[2]。刺參在中國北方已有較大范圍的養(yǎng)殖，目前已經(jīng)獲得了較高的產(chǎn)量，帶來了很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。

由于酶和微生物的作用，新鮮刺參從海水中撈出來后極易自溶[4]。這一特殊性質(zhì)對新鮮刺參的貯藏和運(yùn)輸帶來了極大的影響和挑戰(zhàn)[5]。因此，實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)上需要采取適當(dāng)?shù)募庸し椒?，及時(shí)對新鮮刺參進(jìn)行加工處理，從而延長貯藏期和貨架期。目前，市場上的刺參加工產(chǎn)品主要有淡干刺參、凍干刺參、鹽干刺參、即食刺參和刺參深加工產(chǎn)品[6]。其中，最受歡迎的是即食刺參。其優(yōu)點(diǎn)是能較完整地保留刺參的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，并能保持刺參原有的風(fēng)味和形態(tài)，不需發(fā)泡，食用方便；缺點(diǎn)是口感普遍較軟，保質(zhì)期較短[7]。在即食海參的加工過程中，內(nèi)源酶和微生物已經(jīng)完全滅活，然而在貯藏過程中，仍然出現(xiàn)軟化、變黏的現(xiàn)象，這對產(chǎn)品的質(zhì)量帶來了很大的負(fù)面影響。

因此，研究貯藏過程中高溫高壓海參非酶凝膠劣化(由非酶非微生物因素引起的凝膠化結(jié)構(gòu)逐漸破壞的現(xiàn)象)的過程對工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。CHEN等[7]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫高壓海參體壁在4 ℃貯藏過程中逐漸降解，組織結(jié)構(gòu)和膠原纖維被明顯破壞。PENG等[9]研究了高溫高壓海參在37℃貯藏過程中組織結(jié)構(gòu)的變化情況。結(jié)果表明，高溫高壓海參體壁發(fā)生的非酶凝膠劣化現(xiàn)象是由水分遷移、膠原纖維斷裂和膠原蛋白降解引起的。本論文在已有研究的基礎(chǔ)上，研究4、20、37、50和60 ℃恒溫貯藏過程中高溫高壓海參組織結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。探究了不同貯藏溫度對高溫高壓海參體壁組織結(jié)構(gòu)變化的影響，以及貯藏過程中膠原纖維束和膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化。從而為通過人工干預(yù)，有效地遏制組織結(jié)構(gòu)的劣化速率提供理論依據(jù)，對延長刺參產(chǎn)品的貨架期具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮刺參(Stichopusjaponicus)，青島南山水產(chǎn)品市場。

平板計(jì)數(shù)瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司；NaCl、戊二醛、無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀，美國FTC公司；HD-3A型智能水分活度測量儀，無錫市華科儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HPG-320H型人工氣候箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；JSM-840型掃描電子顯微鏡、JEM-2000EX型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

新鮮刺參去內(nèi)臟后于60 ℃水浴處理3 min，然后在沸水浴中煮沸10 min。去掉頭尾后按照“十字”進(jìn)行4等分。單獨(dú)包裝后在121 ℃熱處理15 min。熱處理完成后，分別在4、20、37、50和60 ℃貯藏30 d，期間取樣并分析。

1.2.2 菌落總數(shù)的測定

采用國標(biāo)GB4789.2—2016的方法測定高溫高壓海參中的菌落總數(shù)[10]。

1.2.3 TPA參數(shù)的測定

將樣品切割成小塊后放到測試臺上，采用5 kg的稱重傳感器。直徑4 mm的圓柱型探頭以50 mm/min的速度下壓，將樣品壓縮至原始高度的70%，循環(huán)操作2次[11]。分析樣品的硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性、恢復(fù)性[12]。

1.2.4 水分含量的測定

采用恒溫干燥法(GB5009.3—2010)測定高溫高壓海參中水分含量。

1.2.5 水分活度的測定

將樣品剪碎后置于水分活度儀中，在25 ℃待平衡后讀取數(shù)據(jù)，測量時(shí)間為20 min[13]。儀器使用前用過夜放置的飽和NaCl溶液進(jìn)行校正。

1.2.6 SEM圖像的測定

將樣品在2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛溶液中4 ℃固定2 h[14]。梯度乙醇脫水后用臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥。離子濺射噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.7 TEM圖像的測定

將樣品放入2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛溶液中4 ℃固定3 h。包埋后用LKB超顯微儀進(jìn)行切片(70 nm)，用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后在透射電子顯微鏡下觀察和拍照[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中菌落總數(shù)的變化情況

由表1可知，高溫高壓熱處理過程中，微生物已完全失活；在不同溫度貯藏0～30 d，均未檢測到微生物。證明本實(shí)驗(yàn)采用的處理?xiàng)l件和貯藏時(shí)間內(nèi)，微生物已經(jīng)被完全滅活。前期的研究結(jié)果表明，內(nèi)源酶也已完全失活。因此，本實(shí)驗(yàn)中高溫高壓海參組織結(jié)構(gòu)的變化均是由非酶非微生物因素引起的。趙園園等[16]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)類似的滅菌條件可以滅活仿刺參中的微生物，側(cè)面證明了此滅菌條件確實(shí)可以完全滅活微生物，排除了微生物對貯藏過程中仿刺參組織結(jié)構(gòu)變化的影響?；谝陨锨疤?，本論文將進(jìn)一步分析非酶非微生物因素對高溫高壓海參體壁組織結(jié)構(gòu)變化的影響。

表1 高溫高壓刺參組織在不同溫度貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Table 1 Changes of the total number of colonies of high temperature and high pressure sea cucumber during storage at different temperatures

注：ND表示未檢出。

2.2 貯藏過程中TPA參數(shù)的變化情況

由圖1-a和圖1-b可知，在不同溫度貯藏0～30 d時(shí)，各組的硬度和咀嚼性均呈逐漸減小的趨勢，表明貯藏溫度的差異并不能改變高溫高壓海參體壁組織非酶凝膠劣化的過程。然而，硬度和咀嚼性減小的速率與貯藏溫度呈顯著性正相關(guān)。推測原因是貯藏過程中高溫高壓海參體壁的組織結(jié)構(gòu)逐漸被破壞和降解，且貯藏溫度的升高加速了組織被破壞的速率[17]。夏培浩等[18]研究了即食海參在25 ℃貯藏30 d過程中刺參品質(zhì)的變化情況，結(jié)果表明，硬度和咀嚼性均呈下降的趨勢。馬桂蘭等[19]研究了刺參在4、20和37 ℃貯藏過程中TPA參數(shù)的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)貯藏過程中各組的硬度和咀嚼性均呈下降趨勢，且下降的速率與貯藏溫度呈正比。一階動(dòng)力學(xué)方程：y=aebx，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究組織劣化的動(dòng)力學(xué)過程[20-21]。采用此劣化模型，對不同溫度貯藏過程中高溫高壓海參的硬度和咀嚼性進(jìn)行方程擬合，結(jié)果如表2所示。通過計(jì)算半數(shù)衰減周期(T50)，發(fā)現(xiàn)硬度和咀嚼性的T50值均隨著貯藏溫度的升高而顯著性下降，證明了硬度和咀嚼性的貯藏穩(wěn)定性與貯藏溫度呈顯著性負(fù)相關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明貯藏溫度是影響高溫高壓海參硬度和咀嚼性的重要因素，且貯藏溫度與硬度和咀嚼性下降的速率呈顯著性正相關(guān)。

由圖1-c可知，當(dāng)4 ℃貯藏時(shí)，高溫高壓海參組織的彈性并沒有發(fā)生明顯的變化；當(dāng)20～60 ℃貯藏時(shí)，彈性隨貯藏時(shí)間的延長而減小，且減小的速率與貯藏溫度呈正比。由圖1-d和圖1-e可知，貯藏溫度與黏聚性和恢復(fù)性的變化沒有明顯的相關(guān)性；在整個(gè)貯藏過程中，黏聚性和恢復(fù)性的變化沒有規(guī)律性。ZHANG等[22]研究了高溫高壓海參組織在37 ℃貯藏過程中彈性和黏聚性的變化規(guī)律，得出結(jié)果與本文一致。

a-硬度；b-黏聚性；c-彈性；d-黏聚性；e-恢復(fù)性圖1 高溫高壓刺參組織在不同溫度貯藏時(shí)TPA參數(shù)的變化Fig.1 Changes of TPA parameters of high temperature and high pressure sea cucumber during differentstorage temperatures

表2 高溫高壓刺參組織在不同溫度貯藏過程中硬度和咀嚼性的擬合結(jié)果Table 2 The fitting results of the hardness and chewiness of high temperature and high pressure sea cucumber during storage at different temperatures

4 ℃20 ℃37 ℃50 ℃60 ℃硬度a6.940±0.1876.361±0.1636.217±0.3476.415±0.2486.494±0.333b-0.024±0.002-0.037±0.003-0.099±0.014-0.301±0.024-0.445±0.047r295.1497.1992.5998.1797.53T50/d28.8818.737.002.301.56咀嚼性a8.103±0.3467.592±0.2947.022±0.3177.377±0.1917.479±0.181b-0.034±0.005-0.072±0.007-0.137±0.014-0.444±0.023-0.787±0.040r288.3296.3696.3299.4199.62T50/d20.389.635.061.560.88

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明貯藏溫度是影響高溫高壓海參質(zhì)構(gòu)特性的關(guān)鍵性因素。因此，可以通過降低貯藏溫度而顯著性減緩TPA參數(shù)的變化速率。

2.3 貯藏過程中水分含量和水分活度的變化情況

由圖2-a可知，在貯藏0～30 d的過程中，各組樣品的水分含量均呈先增大后基本不變的趨勢，且增大的速率與貯藏溫度呈顯著性正相關(guān)。在貯藏過程的后期，水分含量不再發(fā)生明顯變化且各組的水分含量之間并沒有顯著性的差異。原因可能是貯藏過程中，在高溫高壓滅菌過程中失去的水分子又重新回吸到高溫高壓海參的膠原纖維束中[23]。隨著貯藏溫度的升高，復(fù)水過程的速率顯著加快，因此水分含量增加的速率也顯著加快。當(dāng)復(fù)水過程完成后，各組的水分含量不再發(fā)生顯著性變化。PENG等[9]研究了高溫高壓海參組織在37 ℃貯藏過程中水分含量的變化情況，研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)水分含量呈先增大后基本不變的趨勢。

水分活度反映了高溫高壓海參組織中水分子的存在狀態(tài)以及自由水與結(jié)合水的比例[24]。由圖2-b可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，各組的水分活度均呈增大的趨勢，且增大的速率與貯藏溫度呈正比。推測原因是貯藏過程中高溫高壓海參組織不斷地從包裝袋內(nèi)回吸水分，且貯藏溫度的升高加速了回吸速率。另一方面，高溫高壓海參的組織結(jié)構(gòu)在貯藏過程中發(fā)生了非酶凝膠劣化現(xiàn)象，部分機(jī)械水和結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水[25]。CHEN等[8]研究了高溫高壓海參在4 ℃貯藏過程中水分活度的變化情況，同樣發(fā)現(xiàn)各組的水分活度均隨著貯藏時(shí)間的延長而呈現(xiàn)增大的趨勢。

a-水分含量；b-水分活度圖2 高溫高壓海參組織在不同溫度貯藏時(shí)水分含量和水分活度的變化Fig.2 Changes of moisture content and water activity of high temperature and high pressure sea cucumber during different storage temperatures

2.4 貯藏過程中SEM圖像的變化情況

由圖3可知，高溫高壓海參在不同溫度貯藏過程中，組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生了非酶凝膠劣化現(xiàn)象。當(dāng)在4 ℃和20 ℃貯藏時(shí)，體壁組織排列較為致密，結(jié)構(gòu)較為完整，圖中未觀察到明顯的斷裂情況。當(dāng)貯藏溫度升高到37 ℃時(shí)，組織結(jié)構(gòu)被大程度地破壞。圖中可以觀察到明顯的斷裂現(xiàn)象，組織結(jié)構(gòu)呈片層狀結(jié)構(gòu)。在60 ℃貯藏過程中，片層狀結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞和降解，體壁組織呈現(xiàn)出泡沫狀結(jié)構(gòu)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明膠原纖維束結(jié)構(gòu)在貯藏過程中被逐漸破壞，且被破壞的程度與貯藏溫度呈正相關(guān)，并且不同的貯藏溫度并不能改變非酶凝膠劣化的過程。趙圓圓等[16,26]研究了即食刺參在25 ℃貯藏過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化情況，同樣發(fā)現(xiàn)刺參體壁中膠原纖維束的結(jié)構(gòu)逐漸變得混亂。ZHANG等[22]采用VG染色法，研究了高溫高壓海參組織在37 ℃貯藏過程中膠原纖維束結(jié)構(gòu)的變化情況，也發(fā)現(xiàn)膠原纖維束的結(jié)構(gòu)被逐漸破壞和降解。

a-4 ℃；b-20 ℃；c-37 ℃；d-50 ℃；e-60 ℃圖3 高溫高壓海參組織在不同溫度貯藏5 d時(shí)SEM(×5 000)圖像的變化Fig.3 Changes of SEM (×5 000) images of high temperature and high pressure sea cucumber during different storage temperatures for 5 days

2.5 貯藏過程中TEM圖像的變化情況

新鮮的刺參組織在透射電鏡下可以觀察到明暗相間的D-周期結(jié)構(gòu)，這是由膠原纖維的1/4錯(cuò)位排列而引起[27]。由圖4可知，在不同的溫度貯藏5 d后，各組高溫高壓海參的微觀結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著性變化。在TEM圖像中均沒有觀察到D-周期結(jié)構(gòu)，證明膠原纖維的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被較大程度地破壞了。圖中僅能觀察到條帶狀結(jié)構(gòu)，這是D-周期結(jié)構(gòu)部分降解后的產(chǎn)物。在貯藏過程中，條帶狀結(jié)構(gòu)被逐漸破壞和降解，且被破壞的程度與貯藏溫度呈顯著性正相關(guān)。當(dāng)貯藏溫度升高到60 ℃時(shí)，圖中已經(jīng)觀察不到條帶狀結(jié)構(gòu)。組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大程度地?cái)嗔押徒到?，呈現(xiàn)出片段化結(jié)構(gòu)。由以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著貯藏溫度的升高，高溫高壓海參組織被破壞的程度逐漸加重。

a-4 ℃；b-20 ℃；c-37 ℃；d-50 ℃；e-60 ℃圖4 高溫高壓海參組織在不同溫度貯藏5 d時(shí)TEM(×50 000)圖像的變化Fig.4 Changes of TEM (×50 000) images of high temperature and high pressure sea cucumber during different storage temperatures for 5 days

3 結(jié)論

高溫高壓海參組織在不同溫度貯藏過程中，均發(fā)生了非酶非微生物因素引起的劣化現(xiàn)象。微觀結(jié)構(gòu)被破壞程度與貯藏溫度呈顯著性正相關(guān)，因此，可以通過降低貯藏溫度而有效地減小高溫高壓海參體壁結(jié)構(gòu)的破壞程度，從而延長高溫高壓海參產(chǎn)品的貨架期。