杜丹，解修超,2,3*，鄧百萬,2，肖玉祥，吳東平，翟樹峰

1(陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中，723000) 2(陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中，723000) 3(中國謝村北派黃酒研究院，陜西 漢中，723000) 4(陜西省秦洋長生酒業(yè)有限公司，陜西 洋縣， 723300)

我國黃酒產(chǎn)品品種繁多，生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品風格多樣。謝村黃酒源于陜西漢中,是中國北派黃酒的代表之一。黃酒釀造中微生物主要源于酒曲(Wheat Qu)的添加，在酒曲釀造過程中，微生物產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物對黃酒的風味、品質(zhì)及功能具有重要作用。因此，酒曲微生物群落分析對黃酒品質(zhì)的穩(wěn)定和提升具有指導性意義[1]。

目前酒曲微生物的研究主要有分離培養(yǎng)及分子生物學方法。分離培養(yǎng)法能夠獲取純種微生物，但耗時長、工作量大，另外由于客觀條件及認知限制，導致絕大多數(shù)微生物無法分離[2-4]。高通量測序技術(shù)作為一種新型分子生物學方法，能夠同時對上百萬條DNA序列進行測序，能夠直接大規(guī)模準確分析其微生物組成，能更真實、全面、客觀地分析微生物的群落結(jié)構(gòu)[5-7]。高通量測序技術(shù)的應用不僅可以了解酒曲中微生物的群落組成，也可以對酒曲釀造過程中起主導作用的微生物進行針對性分析。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是謝村黃酒中的一種重要的功能性成分，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種代謝活動，具有降血壓、改善神經(jīng)系統(tǒng)、活化肝腎及防止動脈硬化等功能[8]。γ-氨基丁酸可以通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生，乳酸菌[9-11]、大腸桿菌[12-13]、曲霉[14-15]、酵母[16]等多種微生物均可以利用谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化谷氨酸產(chǎn)生GABA。

研究酒曲中的GABA對深入發(fā)掘黃酒中功效成分,在傳統(tǒng)黃酒的基礎(chǔ)上進一步強化黃酒產(chǎn)品的功效性具有重要意義。黃酒中的微生物主要來源于酒曲的添加，因此，酒曲中產(chǎn)GABA微生物的篩選和研究對提高黃酒的保健性具有重要作用。

目前，關(guān)于謝村黃酒中酒曲微生物及代謝產(chǎn)GABA微生物篩選的研究暫無報道。為了解謝村黃酒酒曲微生物組成以及微生物產(chǎn)功能成分GABA的情況，同時增加黃酒研究的廣泛性，擴充黃酒行業(yè)信息，本實驗利用分離培養(yǎng)結(jié)合高通量測序技術(shù)初步探究了謝村黃酒酒曲微生物多樣性，同時篩選生產(chǎn)GABA的微生物，為研制富含GABA的保健型謝村黃酒提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酒曲樣品，由陜西省秦洋長生酒業(yè)有限公司提供；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，OMEGA。

1.1.1 試劑

乙腈為色譜純、鹽酸為優(yōu)級純，其他試劑為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基及配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；

細菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g葡萄糖、10 g酵母粉、5 g蛋白胨、2 g無水乙酸鈉、0.02 g MgSO4·7H2O、0.001 g MnSO4·4H2O、0.001 g NaCl、0.001 g FeSO4·7H2O、10 gL-谷氨酸鈉，加水至1 000 mL，于115 ℃滅菌30 min；

真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：50 g葡萄糖、1 g MgSO4·7H2O、1 g KH2PO4、6 g酵母浸粉、2 g CaCl2、10 gL-谷氨酸鈉，加水至1 000 mL，于115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 儀器設(shè)備

SX-300型立式高壓滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；奧林巴斯CX22型顯微鏡，上海普赫興電科技有限公司；BSAI24S型臺式離心機，賽多利斯科學儀器有限公司；ZWT-2112B型震蕩培養(yǎng)箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；TA-40英國Techne型PCR擴增儀，上海恒久醫(yī)療器械有限公司；TANOAEPS30型電泳儀，上海天能科技有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津國際上海有限公司；Agilent 1200型高效液相儀，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分析酒曲中微生物多樣性

1.2.1.1 酒曲微生物分離純化

粉碎酒曲樣品，取10 g樣品于90 mL無菌水中，37 ℃，140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min。取上清液梯度稀釋為10-2～10-6倍，分別涂布于不同的培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取形狀不同的單菌落于相應的培養(yǎng)基上劃線純化，多次純化后得到單一微生物。所獲得真菌于葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面4 ℃保藏，細菌于50%(體積分數(shù))甘油4 ℃保藏。

1.2.1.2 酒曲微生物鑒定

通過形態(tài)學觀察將分離得到的細菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進行平板劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)特征，通過革蘭氏染色，利用顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。將分離得到的真菌接種至培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)特征，利用顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

分子生物學鑒定:細菌用水煮法提取單菌落基因組，采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)對基因組進行擴增。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。真菌采用CTAB法提取單菌落基因組，采用通用引物ITS1( 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)對基因組進行擴增。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物電泳檢測后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中GenBank進行BL-AST(basic local alignment search tool)比對，與已知序列確定同源關(guān)系。

1.2.2 高通量測序分析酒曲中微生物多樣性

1.2.2.1 基因組DNA提取

采用細菌基因組DNA提取試劑盒對樣品細菌基因組DNA進行提取，采用真菌基因組DNA提取試劑盒對樣品真菌基因組DNA進行提取。

1.2.2.2 PCR擴增與高通量測序

利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA進行精確定量，以確定PCR反應中應加入的DNA的量。細菌采用引物341F(5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)與805R(5′-GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC-3′)擴增細菌16sV3-V4區(qū)，真菌采用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GC TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增真菌ITS區(qū)。擴增得到的片段經(jīng)純化回收處理后由生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量測序。

1.2.2.3 序列處理與數(shù)據(jù)分析

通過barcode區(qū)分樣品序列，并對各樣本序列做質(zhì)量控制。去除非特異性擴增序列及嵌合體，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。根據(jù) 97%的序列相似度對有效序列進行同源比對，并對操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)進行聚類，在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取OTU聚類中的代表性序列，選擇豐度最高的序列作為OTU的代表性序列，獲取物種在各個分類水平上的群落結(jié)果。計算香農(nóng)指數(shù)(Shannon Index)、Chao1指數(shù)及文庫覆蓋率(Coverage)。

1.2.3 酒曲中產(chǎn)GABA菌株的篩選

1.2.3.1 菌株活化及發(fā)酵培養(yǎng)

細菌的活化及發(fā)酵培養(yǎng)：取保藏的細菌菌株進行活化傳代培養(yǎng)，從活化的固體培養(yǎng)基上挑取適量菌體，接入到相應的種子培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)(160 r/min)24 h。然后以2%(質(zhì)量分數(shù))的接種量接種至細菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃靜置或振蕩培養(yǎng)(160 r/min)3 d。

真菌的活化及發(fā)酵培養(yǎng)：取保藏的真菌菌株進行活化傳代培養(yǎng)，活化后接種至固體斜面，待長滿后，制備孢子液，調(diào)節(jié)濃度為107CFU/mL。以2%(質(zhì)量分數(shù))的接種量接種至真菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，160 r/min，30 ℃發(fā)酵5 d。

1.2.3.2 薄層層析定性測定GABA

取適量發(fā)酵液以8 000 r/min離心20 min，取上清待測。以1 mg/mL GABA標準液，1 mg/mLL-Glu標準液為對照，使用毛細管點樣，點樣間距2 cm，點樣后迅速用吹風機吹干，以防止樣品擴散。展層劑為V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=4∶1∶3，顯色劑為0.4%茚三酮水飽和正丁醇試劑，置于80 ℃烘箱顯色15 min。

1.2.3.3 高效液相定量測定GABA

實驗參考QB/T 4356—2012，黃酒中游離氨基酸的測定參考高效液相色譜法[17]。

色譜條件：色譜柱C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流量1 mL/min；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃；檢測波長254 nm。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of HPLC

2 結(jié)果與分析

2.1 酒曲中微生物分離鑒定

2.1.1 細菌分離結(jié)果

利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從酒曲中分離出10株細菌，其中包括2株乳酸菌。部分細菌菌落及顯微鏡圖片見圖1。對細菌菌株進行16S rRNA基因擴增和測序，測序結(jié)果在NCBI上用BLAST進行同源性分析，尋找模式菌株16S區(qū)基因序列，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，見圖2。通過16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析得知，酒曲中細菌主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)，以及少量腸球菌屬(Enterococcus)。鑒定結(jié)果見表2。

a-N1菌落圖;b-N41菌落圖;c-M29菌落圖;d-N1顯微圖;e-N41顯微圖;f-M29顯微圖圖1 部分細菌菌落及顯微鏡檢圖Fig.1 Partial bacterial colonies and micrograph

表2 酒曲中分離細菌的比對及統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Comparison and statistical results of isolated bacteria in Wheat Qu

菌株編號序列長度/bp相似度/%相似菌種N-11 45299Bacillus subtilisN-51 44899Bacillus subtilisN-81 45499Bacillus tequilensisN-91 45599Bacillus aryabhattaiN-411 45999Bacillus licheniformisN-451 45599Bacillus oryzaecorticisN-541 45799Bacillus amyloliquefaciensN-631 45599Bacillus cereusM-141 16499Enterococcus duransM-291 17899Enterococcus faecium

圖2 細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic relationship of 16SrRNA sequences of bacterial

2.1.2 真菌分離結(jié)果

利用分離培養(yǎng)方法從酒曲中共分離出17株真菌，其中有1株酵母菌，部分真菌菌落及鏡檢圖片見圖3。分別進行ITS基因擴增和測序，測序結(jié)果在NCBI上用BLAST進行比對分析，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

a-Z6菌落圖;b-P17菌落圖;c-Z9菌落圖;d-Z6顯微圖;e-P17顯微圖;f-Z9顯微圖圖3 部分真菌菌落及顯微鏡檢圖Fig.3 Partial fungi colonies and micrograph

圖4 真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic relationship of ITS sequences of fungi

通過ITS基因系統(tǒng)發(fā)育分析得知，酒曲中真菌有橫梗霉屬(Lichtheimia)、枝孢菌屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、根毛霉屬(Rhizomucor)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)、復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)。鑒定結(jié)果見表3。

表3 酒曲中分離真菌的比對及統(tǒng)計結(jié)果Table 3 Comparison and statistical results of isolated fungi in Wheat Qu

2.2 酒曲中微生物高通量測序

2.2.1 多樣性分析

群落生態(tài)學中研究微生物多樣性，可以通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)反映微生物群落的豐度和多樣性。本實驗采用稀釋曲線(rarefaction curve)及多樣性指數(shù)(diversity index)分析樣本的多樣性。本試驗對細菌(C1)和真菌(D1)樣本所有有效序列數(shù)計算后的Shannon指數(shù)稀釋曲線見圖5。

圖5 Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.5 The rarefaction curve of shannon index

對樣本有效序列數(shù)計算后的多樣性指數(shù)分析見表4。本實驗樣本中真菌的chao1指數(shù)遠大于細菌。說明謝村黃酒酒曲中真菌物種豐富度遠高于細菌。試驗樣本中真菌的Shannon指數(shù)與細菌基本一致，同時從Shannon指數(shù)稀釋曲線可以看出，隨著抽樣序列數(shù)的增多，細菌(C1)和真菌(D1)的Shannon指數(shù)趨于穩(wěn)定。說明其物種的均一性基本相同。實驗樣本中真菌與細菌的文庫覆蓋率均較高，說明本次測序結(jié)果基本代表樣本的真實情況。

表4 多樣性指數(shù)分析Table 4 The analysis of diversity index

2.2.2 樣本群落結(jié)構(gòu)分析

謝村黃酒酒曲屬水平群落結(jié)構(gòu)分析見圖6。細菌(C1)在屬水平上可劃分為48個菌屬和其他未分類種群，主要包含克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、嗜酸鏈霉菌屬(Streptacidiphilus)、小球菌屬(Pediococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等。其中優(yōu)勢菌屬為克羅彭斯特菌屬(相對豐度比例為41.6%)、芽孢桿菌屬(相對豐度比例為9.23%)、乳桿菌屬(相對豐度比例為8.65%)、海洋桿菌屬(相對豐度比例為5.51%)。

圖6 屬水平群落豐度分析Fig.6 The community abundance analysis of the genus level

真菌(D1)在屬水平上可劃分為18個菌屬和其他未分類種群，主要包含耐干霉菌屬(Xeromyces)、橫梗霉屬(Lichtheimia)、根毛霉屬(Rhizomucor)、淀粉霉屬(Amylomyces)、復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)、根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)、曲霉屬(Aspergillus)等。其中優(yōu)勢菌屬為耐干霉菌屬(40.18%)、橫梗霉屬(22.59%)、根毛霉屬(15.35%)、淀粉霉屬(11.18%)、復膜孢酵母屬(8.47%)。

2.3 酒曲中產(chǎn)GABA菌株篩選結(jié)果

將分離純化得到的菌株經(jīng)液體發(fā)酵后進行適當處理，采用薄層層析法對產(chǎn)GABA菌株進行定性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有6株能夠利用L-谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)GABA的菌株。挑選能夠產(chǎn)GABA的菌株，采用異硫氰酸苯酯柱前衍生高效液相定量檢測，通過對比GABA標準品圖譜，發(fā)現(xiàn)這些樣品在相同的時間出現(xiàn)峰值。經(jīng)計算，菌株合成GABA的量見表5。其中菌株N1的產(chǎn)量最高，達到0.78 g/L。圖7、圖8為衍生物液相色譜圖和標準品液相色譜圖，圖9為樣品N1液相色譜圖。

表5 菌株轉(zhuǎn)化GABA產(chǎn)量Table 5 Strain transforming GABA production

圖7 衍生物液相色譜圖Fig.7 Chromatogram of derivative

圖8 GABA標準品液相色譜圖Fig.8 Chromatogram of standard GABA sample

圖9 菌株N1發(fā)酵液液相色譜圖Fig.9 Chromatogram of fermentation of N1

3 結(jié)果與討論

利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法分離出的細菌主要為芽孢桿菌屬與腸桿菌屬，真菌主要有橫梗霉屬、枝孢菌屬、曲霉屬、木霉屬、根毛霉屬、青霉屬、毛霉屬及復膜孢酵母屬。高通量測序結(jié)果表明，酒曲中細菌的優(yōu)勢菌屬為克羅彭斯特菌屬(41.6%)、芽孢桿菌屬(9.23%)、乳桿菌屬(8.65%)、海洋桿菌屬(5.51%)，真菌優(yōu)勢菌屬有耐干霉菌屬(40.18%)、橫梗霉屬(22.59%)、根毛霉屬(15.35%)、淀粉霉屬(11.18%)、復膜孢酵母屬(8.47%)，以及少量根霉屬、毛霉屬、曲霉屬。真菌的傳統(tǒng)分離結(jié)果與高通量測序結(jié)果較為相符，均檢測到橫梗霉屬、根毛霉屬等，但細菌僅分離純化出芽孢桿菌屬，其他菌屬的細菌未分離到。因此，分析酒曲微生物的群落結(jié)構(gòu)時，采用2種及多種分析方法能得到更加全面、客觀的結(jié)果。

通過文獻[4,18-20]檢索發(fā)現(xiàn)，謝村黃酒優(yōu)勢細菌屬與南方黃酒相比差異較大，如Kroppenstedtia主要在白酒發(fā)酵中檢測較多，在黃酒酒曲中未見報道，這可能與酒廠同時進行白酒生產(chǎn)相關(guān)，海洋桿菌屬在酒曲有較大比例，可能主要來源于水中。而優(yōu)勢真菌屬之間差異相對較小。由此可以發(fā)現(xiàn)，不同制曲原料及制曲環(huán)境對酒曲中微生物多樣性至關(guān)重要。

為了解酒曲中微生物代謝產(chǎn)生GABA的能力，實驗對所純化的微生物進行液態(tài)發(fā)酵，采用薄層層析法結(jié)合高相液相，對發(fā)酵液中GABA濃度進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、腸球菌屬、青霉屬、根毛霉屬菌株有轉(zhuǎn)化谷氨酸產(chǎn)生GABA的能力。其中芽孢桿菌屬N1轉(zhuǎn)化能力最強，發(fā)酵液中GABA濃度達0.78 g/L。芽孢桿菌屬是酒曲中重要的一類微生物，在黃酒釀造中具有重要作用[21]。菌體在生長過程中能夠產(chǎn)生多種酶類，如淀粉酶[22]、蛋白酶、纖維素酶、凝乳酶[23]等，在分解酒曲原料的同時能夠產(chǎn)生一些香味物質(zhì)[4]。因此，芽孢桿菌在黃酒釀造中具有應用潛力，后期研究可以嘗試通過強化安全性高的芽孢桿菌來提高酒曲中GABA的含量，以期制備一款富含GABA的謝村黃酒。

酒曲發(fā)酵過程中微生物種類繁多，且微生物的生長在動態(tài)變化，本研究僅對單一時期的微生物進行了分析，而對于了解謝村黃酒酒曲微生物群落及不同時期微生物的變化情況不夠全面和充分。同時，由于對于可培養(yǎng)微生物的分離鑒定不夠完善和忽視了不同時期微生物之間的相互作用對微生物產(chǎn)GABA的促進或抑制作用,對于謝村黃酒酒曲中微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的能力了解的也較為片面。因此在后期的研究中，需對這些問題進行深入研究。