代曉凝，劉麗莉*，陳珂，李媛媛，郝威銘，楊曉盼

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽,471023) 2(食品加工與安全國家級教學示范中心(河南科技大學)，河南 洛陽，471023)

蛋清粉來源豐富，儲存運輸方便，具有較好的保藏性能，是一種優(yōu)質蛋白資源，被廣泛應用于食品行業(yè)。隨著食品工業(yè)的迅速發(fā)展，蛋清粉的應用領域不斷擴大，對專用功能性蛋清粉的要求也更為嚴格[1]。雞蛋清粉的凝膠特性是其重要的功能特性之一，工業(yè)上常利用此特性生產火腿腸、魚糜等食品。然而我國對蛋清粉凝膠特性的研究較為落后，因此高凝膠型蛋清粉的研發(fā)已迫在眉睫。在雞蛋清粉的生產加工過程中，干燥方式是影響蛋清粉功能特性的重要因素之一。因此采用適當?shù)母稍锓绞綄﹄u蛋清進行干燥處理，開發(fā)出具有更高凝膠特性的蛋清粉，對于拓展其應用領域具有非常重要的市場價值。

目前，已有很多國內外學者對蛋粉進行研究。劉靜波等[2]、趙媛等[3]對比研究了多種干燥方式所得全蛋粉的沖調特性，結果表明，噴霧干燥所得全蛋粉沖調性能最高，為生產具有良好沖調性蛋粉提供了理論指導。沈青等[4]對比研究噴霧干燥和真空冷凍干燥所得全蛋粉的理化性質和功能性質，結果表明，真空冷凍干燥全蛋粉的溶解度、起泡性及乳化性均高于噴霧干燥。陶汝青等[5]采用不同的溫度和時間對大豆分離蛋白進行處理，得出在熱處理溫度90 ℃、15 min，并保溫30 min的條件下制備大豆分離蛋白凝膠的效果最佳。AYADI等[6]研究了噴霧干燥溫度對蛋清蛋白凝膠特性的影響，結果表明，進口溫度在110～125 ℃范圍內，隨溫度的升高凝膠強度也逐漸增強。SREENIVASULA等[7]研究發(fā)現(xiàn)射頻處理標準蛋清粉，不會影響其色澤和溶解度，但可以提高其起泡性和凝膠特性。KATEKHONG等[8]研究了噴霧干燥溫度對蛋清粉的物理性能、溶解度和膠凝性能的影響，并確定了樣品的儲存穩(wěn)定性與溫度和時間的關系，為蛋白粉的生產和儲存提供了依據(jù)。JUNHUA等[9]研究發(fā)現(xiàn)堿或鹽誘導的雞蛋清體系的流變學特性與凝膠特性、表面疏水性、分子表面電荷和蛋白質二級結構的變化密切相關。ZHOU等[10]采用冷凍干燥與微波真空干燥結合的方式干燥鴨蛋，可以明顯縮短干燥時間，且生產質量與真空冷凍干燥得到的鴨蛋粉類似。SU等[11]研究了不同共混比和蛋白濃度的大豆蛋白分離蛋白/蛋清蛋白復合凝膠的凝膠性質和二級結構，確定了最佳凝膠特性的蛋白比例。

目前，前人已比較分析了不同干燥方法對全蛋粉沖調性能、起泡性、乳化性的影響，對于蛋清粉的改性也已有報道[12]，但有關不同干燥方式對蛋清粉蛋白結構特性及凝膠形成機理影響方面的研究還少有報道，因此，本試驗采用熱風干燥法(hot air drying，HD)、噴霧干燥法(spray drying，SD)和冷凍干燥法(freeze drying，F(xiàn)D)對雞蛋清進行干燥處理，探究干燥方式對雞蛋清粉蛋白質的凝膠特性和結構特性的影響，以期為蛋白質改性提供基礎研究，找出有效提高蛋白質凝膠特性的方法，為雞蛋清粉的深加工及應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋,河南省洛陽市大張超市；KBr(分析純)，天津市光復經濟化工研究所；KOH(分析純)，廣東西隴化工試劑廠；DTNB(分析純)，洛陽試劑廠；戊二醛(分析純)，天津中信凱泰有限公司；叔丁醇(分析純)，上海利博化工實業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

TF-FD-27S真空冷凍干燥機，上海田楓實業(yè)有限公司；OM-1500噴霧干燥機，上海順儀實驗設備有限公司；101A-4電熱恒溫鼓風干燥箱，南京華奧干燥設備有限公司；SMS TA.XT Epress Enhanced食品物性分析儀，英國SMS公司；Cary eclpise熒光分光光度計，美國Aglient Cary elipse公司；UV2600紫外分光光度儀，日本日立公司；Q200差示掃描量熱儀，瑞士Mettler-Toledo公司；TM3030Plus電子掃描顯微鏡，日本島津公司；VERTEX70傅里葉紅外光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 雞蛋清粉的制備

參照劉靜波等[2]的方法制備蛋清粉研究的基礎上，在保證不影響蛋粉感官及營養(yǎng)品質的條件下設定干燥參數(shù)。

真空冷凍工藝流程：

鮮蛋→打蛋→分離蛋清→攪拌、過濾→自然發(fā)酵(48 h)→預凍(-20 ℃，2 h)→冷凍干燥(壓力15 MPa，溫度-60 ℃，24 h)→過篩→包裝

噴霧干燥工藝流程：

鮮蛋→打蛋→分離蛋清→攪拌、過濾→自然發(fā)酵(48 h)→噴霧干燥(進風溫度170 ℃，出風溫度 80 ℃)→過篩→包裝

熱風干燥工藝流程：

鮮蛋→打蛋→分離蛋清→攪拌、過濾→自然發(fā)酵(48 h)→熱風干燥(物料厚度4 mm，溫度60 ℃)→過篩→包裝

1.3.2 雞蛋清凝膠的制備

用蒸餾水將蛋清粉稀釋成質量濃度100 g/L的溶液，攪勻后，倒入25 mL的燒杯中于80 ℃加熱45 min，取出后在4 ℃的冰箱中冷藏過夜即得凝膠。

1.3.3 雞蛋清粉凝膠特性分析

1.3.3.1 凝膠強度特性分析

根據(jù)HUANG等[13]的方法測定凝膠強度。將制備的凝膠取出，在室溫下放置20 min后，采用TPA模式，P/0.5的探頭測定凝膠強度(g)。測試速度設為：測前5 mm/s，測中2 mm/s，測后2 mm/s，觸發(fā)力設為3 g。

1.3.3.2 凝膠失水率分析

取一定質量的凝膠，切成大小均一的小粒，10 000 r/min離心10 min，取出并吸干凝膠表面水分、稱重，凝膠失水率按照公式(1)計算：

(1)

式中：m0，待測凝膠質量，g；m1，離心后凝膠質量，g。

1.3.4 色差分析

將蛋清粉凝膠用色差分析儀進行色度測量，采集L*(明度)、a*(紅度)、b*(黃度)，與白色標板進行比較，分析色差的變化。每個樣品測量值取3次測量的平均值。

1.3.5 干燥處理后蛋清蛋白的結構與理化性質分析

1.3.5.1 巰基含量分析

根據(jù)LIU等[14]的方法測定雞蛋清粉凝膠樣品的總巰基及表面巰基含量?？値€基含量測定：將蛋清粉用PBS緩沖液配制成2 mg/mL(質量濃度)的溶液，取0.5 mL加入到2 mL緩沖液(8%SDS、8 mol/L尿素、0.1 mol/L PBS，pH 7.4)中，并加入 50 μL 10 mmol/L Ellman試劑(pH 7.4)，混勻后靜置20 min，在412 nm處測得吸光度A412；表面巰基含量的測定：取50 μL的Ellman試劑加入到蛋清溶液(0.5 mg/mL，2.5 mL)混勻后靜置 25 min，于 412 nm下測定吸光度。巰基含量按公式(2)計算:

(2)

式中：D，稀釋倍數(shù);ρ，溶液最終質量濃度，mg/mL。

1.3.5.2 表面疏水性分析

根據(jù)CHELH等[15]的方法并稍作修改：將3種雞蛋清粉溶于Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)制成2.5 mg/mL(質量濃度)的溶液；吸取1 mL待測液和200 μL、1 mg/mL的溴酚藍(BPB)溶液置于10 mL離心管中，混勻后，離心15 min(10 000 r/min)，取上清液稀釋10倍并于595 nm處測得吸光度A1，以Tris-HCl緩沖液替代樣品溶液，其他操作一致，作為對照，測定其吸光度A0。表面疏水性按公式(3)計算：

(3)

式中：BPB，溴酚藍結合量，%；A0，以Tris-HCl緩沖液為對照時測定的吸光值；A1，上清液稀釋10倍后測定的吸光值。

1.3.6 傅里葉紅外光譜(fourier transform infrared, FT-IR)分析

將處理后的蛋清粉樣品與KBr混勻后，進行手動壓片，用FT-IR儀進行掃描。分辨率設為4 cm-1，4 000～400 cm-1進行掃描，用Peak Fit v4.12軟件對紅外光譜的酰胺Ⅰ帶進行去卷積處理和二階導數(shù)擬合。

1.3.7 差示掃描熱量(differential scanning calorimetry, DSC)分析

使用DSC法測定干燥處理后的蛋清蛋白變性溫度。稱取6～8 mg蛋清粉樣品于坩鍋中，以空坩鍋作為對照，測試參數(shù)：氮氣流速設定20 mL/min，升溫速率設定10 ℃/min，并在20～150 ℃掃描得到曲線。

1.3.8 熒光光譜(FS)分析

將3種雞蛋清粉樣品溶于Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液，配成0.5 mg/mL(質量濃度)的蛋白溶液，分別放入熒光分光光度計。激發(fā)波長為295 nm，掃描波長為300～450 nm進行掃描。

1.3.9 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)分析

將凝膠切成薄片狀，用戊二醛(體積分數(shù)2.5%)固定5 h以上，并用pH 7.4的磷酸緩沖液洗滌3次，單次15 min。然后用體積分數(shù)60%(2次)、70%、80%(2次)、90%、100%乙醇梯度脫水，單次15 min。樣品用叔丁醇浸泡置換乙醇，采用真空冷凍干燥對凝膠樣品進行干燥處理。噴金后，用掃描電鏡觀察凝膠樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所涉及到的測定結果均做3次重復，數(shù)據(jù)用Origin 9.0軟件作圖，用SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 雞蛋清粉凝膠特性分析

影響蛋清凝膠性的原因主要是蛋清蛋白的變性和聚集程度。由圖1可知,3種干燥方式蛋清粉凝膠硬度差異顯著(P<0.05)，SD和HD蛋清粉的凝膠硬度比FD分別提高了49.47%、23.87%；其原因可能是干燥溫度越高，蛋白質變性程度越大，發(fā)生分子間聚集有利于形成規(guī)則的蛋白質網絡結構，從而有助于蛋清粉凝膠性能的提高。HD干燥溫度較低不能更好地形成蛋白網絡結構，且HD蛋清粉溶解度差,導致蛋粉凝膠硬度小于SD蛋清粉[2]。陶汝青等[5]的研究表明在一定溫度范圍內，蛋白質凝膠強度隨溫度上升而增加，與本研究結果一致。失水率為SD(27.4%)

圖1 干燥方式對雞蛋清粉凝膠硬度及凝膠失水率的影響Fig.1 Effect of drying method on gel hardness and gel water loss rate of egg white powder注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 雞蛋清粉凝膠色差分析

色澤是食品感官評價的一個重要指標，直接影響產品外觀，由表1可知，3種凝膠有著一定的差異。從蛋清粉的L*值(明度)可以看出FD>HD>SD(P<0.05)；SD和HD蛋粉凝膠的a*值(紅度)和b*值(黃度)均顯著高于FD，表明SD與HD蛋粉凝膠顏色更深，這種顏色上的差別是由于不同的干燥方式制得的蛋白粉顆粒形態(tài)、大小以及表面結構不同造成的，另一原因可能是干燥方式不同使樣品發(fā)生不同程度的美拉德反應所致[16]。蛋清液經自然脫糖后仍有少量葡萄糖存在，干燥溫度越高，美拉德反應速率越快，因此SD比HD蛋清凝膠的顏色稍深[17]，美拉德反應的發(fā)生能夠在一定程度上提高凝膠硬度，這也是SD蛋清凝膠硬度較大的原因。

表1 干燥方式對雞蛋清粉凝膠色澤的影響Table 1 Effect of drying method on gel color of egg white powder

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 干燥處理后雞蛋清蛋白的結構與理化性質分析

2.3.1 巰基含量及表面疏水性分析

蛋白質變性程度及聚集度是影響蛋清蛋白凝膠性的主要因素；蛋白質的疏水性是配位體間非共價鍵相互作用的結果，影響其穩(wěn)定性、構象及凝膠性[18]，并且與疏水基團暴露的程度有關。研究表明溴酚藍可與蛋白質分子表面的疏水性結合位點結合，因此可以作為蛋白質表面疏水性的指標[14]。

圖2 干燥方式對雞蛋清粉巰基含量及表面疏水性的影響Fig.2 Analysis of total thiol, surface sulfhydryl content and surface hydrophobicity of egg white powder after drying

由圖2可知，3種干燥方式均對蛋清蛋白表面疏水性有不同程度的影響，SD、HD與FD的表面巰基含量分別為5.33%、4.50%和3.71%，差異顯著(P<0.05)，且與凝膠硬度成正比。這可能與蛋清中含量最高的卵白蛋白變性有關；其含有4種自由疏水基團但常包埋于分子內部[19]，而熱處理破壞了卵白蛋白的空間結構使疏水基團暴露，干燥溫度越高暴露程度越大，因此，SD蛋粉的表面巰基含量比HD更大。SD和HD(44.25%和45.00%)比FD(47.63%)蛋清粉總巰基的含量降低了3.38%、2.63%(P<0.05)。3種樣品的表面巰基含量為SD>HD>FD，而其總巰基含量為SDSD(63.65%)>HD(58.79%)(P<0.05)。SD與HD蛋清粉的表面疏水性比FD分別降低了2.04%、6.9%；其原因可能是干燥過程溫度升高導致蛋白質與葡萄糖發(fā)生美拉德反應，引入親屬基團所致[6]。遲玉杰等[22]發(fā)現(xiàn)蛋清經糖基化處理后，其凝膠硬度提高，因此，SD與HD的凝膠硬度比FD的更大。

2.3.2 FT-IR分析

蛋白質的凝膠特性不僅與加工方法和疏水基有關，還與蛋白質的結構特性密切相關，F(xiàn)T-IR可分析蛋白質分子間和分子內部氫鍵以及N—H、O—H鍵的伸縮振動強度等變化規(guī)律。

圖3 干燥后雞蛋清粉紅外光譜圖Fig.3 Analysis of fourier transform infrared spectrometer of egg white powder after drying

表2 雞蛋清粉酰胺I帶二級結構組成比例單位：%

Table 2 Egg powder amide I band secondary structure composition ratio

2.3.3 DSC分析

DSC常用于蛋白質熱變性過程的熱力學研究。蛋白質受熱吸收能量，氫鍵斷裂，蛋白質分子展開變?yōu)闊o序結構，即為熱變性過程。峰值溫度(Tp)代表蛋白質熱穩(wěn)定性與聚集程度。熱焓值(ΔH)的大小通常能夠反映蛋白質結構的變化，熱焓值越小蛋白質結構展開就越徹底。由圖4可知，3種干燥蛋清粉均出現(xiàn)了明顯的放熱峰。3種樣品的Tp值順序為：SD>HD>FD；SD和HD蛋清粉的熱變性溫度較FD的分別提高了13.9和3.56 ℃。而如表3所示，熱焓值順序為：SD

圖4 干燥后雞蛋清粉的差示掃描量熱分析Fig.4 Analysis of differential scanning calorimetry of egg white powder after drying

表3 干燥后雞蛋清粉的熱變性溫度及熱焓值Table 3 Heat denaturation temperature and enthalpy value of egg white powder after drying

干燥方式峰值溫度(Tp)/℃熱焓值(ΔH)/(J·g-1)SD110.36±0.05128.88±0.4HD100.02±0.01149.46±0.8FD96.46±0.02174.95±0.5

上述結果與KATO等[28]的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)蛋清焓值的降低，表明蛋白結構展開，同時伴隨其凝膠硬度的增加。一方面可能是SD和HD比FD溫度高，使樣品變性程度大，α-螺旋結構展開，暴露出更多的疏水基團。蛋白質熱穩(wěn)定性與其氨基酸組成成分相關，疏水性氨基酸所占比例越高其熱穩(wěn)定性越好[29]。另一方面可能是較高的干燥溫度使蛋白質與蛋清粉中殘留的葡萄糖發(fā)生美拉德反應,提高了熱穩(wěn)定性[30]。

2.3.4 熒光分析

基于前面對蛋清蛋白熱穩(wěn)定性及疏水性研究的基礎上，采用熒光光譜在三級結構上來研究3種樣品的蛋白質構象差異。不同干燥方式會引起蛋白質結構發(fā)生不同程度的變性，芳香族氨基酸殘基的位置及所處微環(huán)境也隨之發(fā)生改變[31]。

圖5 干燥后雞蛋清粉的熒光光譜Fig.5 Analysis of fluorescence spectroscopy of egg white powder after drying

由圖5可知，3種樣品在340 nm處的吸收峰強度順序為：FD>SD>HD，但是熒光峰的位置未有明顯遷移，隨著干燥方式不同對芳香族氨基酸的微環(huán)境的影響也不同。熒光強度與表面疏水性呈正相關，SD與HD的熒光強度比FD弱，發(fā)生熒光猝滅可能是由于葡萄糖與蛋白質分子的結合對色氨酸有屏蔽作用；而SD的熒光強度大于HD，其原因可能是SD的干燥溫度更高使蛋清蛋白變性程度大，色氨酸側鏈基團暴露于溶劑中，微環(huán)境極性增強，熒光強度增強，文獻表明，一定溫度范圍內，加熱溫度與蛋白凝膠硬度呈正相關[32]。

2.3.5 掃描電鏡(SEM)分析

蛋白質凝膠化是變性蛋白分子在一定程度上聚集形成的連續(xù)網絡結構。由圖6可知，在相同放大倍數(shù)下3種樣品均可以形成多空有序的結構，類似于“蜂窩”狀，此結構賦予了蛋清更好的凝膠性[33]；但樣品間孔徑大小不同(SD

圖6 干燥后雞蛋清粉凝膠的微觀結構分析(×5 000)Fig.6 Analysis of gel microstructure of egg white powder after drying

3 結論

(1)通過對比3種不同蛋清粉樣品可知，干燥方式對蛋清粉的凝膠特性、凝膠色澤、表面疏水性、巰基含量、結構等均有顯著影響；通過對蛋清粉凝膠特性及色差分析，得出SD、HD較FD得到的蛋清粉凝膠硬度分別提高了49.47%、23.87%。凝膠失水率與凝膠強度成反比，分別為27.4%、30.1%、31.2%。3種蛋粉L*值為：FD>HD>SD；SD和HD的b*顯著高于FD(P<0.05)。

(2)通過對蛋清粉蛋白質表面疏水性、巰基含量及結構分析得出，SD和HD與FD蛋清粉相比游離巰基含量分別增加了44.84%、22.28%(P<0.05)。表面疏水性為：FD>SD>HD(P<0.05)。SD、HD蛋清粉的熱變性溫度較FD的分別提高了13.9、3.56 ℃；熱焓值較FD的分別降低了46.07和25.49 J/g；結構分析表明，SD和HD相比于FD均可使蛋清蛋白結構展開，表面巰基暴露，且α-螺旋結構減少，β-轉角結構增加，凝膠結構密度增大、孔洞減小。但SD的作用效果更加明顯，因此可以更有效地改善蛋清粉蛋白的凝膠性質。